[發(fā)明專利]一種基于膠原蛋白的軟骨再生載體的制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910629134.2
• 申請(qǐng)日: 2019-07-12
• 公開（公告）號(hào): CN110302423A
• 公開（公告）日: 2019-10-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭文弘;何擁軍;李巧美;劉蘇汶;郭文靜;夏偉;軒秀玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州藍(lán)朗生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): A61L27/24
• 分類號(hào): A61L27/24;A61L27/50;A61L27/54;C12P21/06;C07K1/30
• 代理公司: 北京天奇智新知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11340
• 代理人: 儲(chǔ)德江

本發(fā)明公開一種基于膠原蛋白的軟骨再生載體的制備方法，包括牛跟腱洗凈處理、酶解、離心取上清制備膠原粗提液；中性鹽鹽析離心獲得膠原蛋白沉淀，并加入磷酸鹽緩沖液獲得膠原蛋白原液；在膠原蛋白原液中加入一定體積的酸，通過分散器分散2～10min；再次加入一定體積的酸，通過分散器分散1～10min，通過攪拌機(jī)攪拌10～180min，使用均質(zhì)機(jī)、分散器或攪拌機(jī)使蛋白溶液均一后，將膠原蛋白溶液分裝于離心杯中配平，1000～2500r/min離心5～35min。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種軟骨再生載體的制備方法，尤其是一種基于膠原蛋白的軟骨再生載體的制備方法。

背景技術(shù)

目前臨床上已有多種材料和方案用于軟骨損傷的修復(fù)，但都存在不同程度的應(yīng)用缺陷，如微骨折術(shù)原型是軟骨下骨鉆孔術(shù)，簡(jiǎn)單有效，短期效果良好，但是新形成的修復(fù)組織不是真正的關(guān)節(jié)面軟骨，更多是纖維軟骨成分，時(shí)間久了會(huì)變硬失去軟骨功能。如基質(zhì)誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞移植技術(shù)，作為臨床上應(yīng)用最為廣泛的軟骨組織工程技術(shù)，的確能為軟骨修復(fù)提供良好的選擇，但這項(xiàng)技術(shù)需要一期手術(shù)獲取自體細(xì)胞，進(jìn)行分離、培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化，再進(jìn)行二期手術(shù)移植，操作難度大，費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)，費(fèi)用較高。

而最新研究發(fā)現(xiàn)，膠原蛋白可以誘導(dǎo)人體干細(xì)胞生成新的軟骨。植入人體后，膠原蛋白作為自體軟骨細(xì)胞再生支架，植入部位周圍結(jié)締組織細(xì)胞，將生長(zhǎng)進(jìn)入膠原蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，逐漸形成與正常組織類似的仿生結(jié)構(gòu)，從而起到治療作用。另膠原蛋白具有可吸收降解特性，可逐漸被體內(nèi)蛋白酶分解，安全無毒。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種基于膠原蛋白的軟骨再生載體的制備方法。采用無菌低熱源的膠原蛋白原液，在局部百級(jí)環(huán)境下配制成可用于關(guān)節(jié)軟骨損傷、創(chuàng)傷性或退行性關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)等疾病的軟骨再生載體。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：包括以下步驟：步驟一，膠原蛋白原液提取，步驟二，配制6～20mg/ml左右濃度的膠原蛋白溶液；步驟三，均質(zhì)膠原蛋白溶液；步驟四，膠原蛋白溶液除泡。

作為對(duì)本發(fā)明所述的一種基于膠原蛋白的軟骨再生載體的制備方法的改進(jìn)：所述膠原蛋白原液的提取步驟如下：①牛跟腱解凍，去血水、表面異物和筋膜，用溶液進(jìn)行一次預(yù)處理；②步驟一處理的牛跟腱去脂肪膜，用溶液進(jìn)行二次預(yù)處理；③步驟二處理完的牛跟腱冷凍后切片，用溶液進(jìn)行前處理；④將前處理完的牛跟腱切片持續(xù)酶解，離心取上清制備膠原粗提液；⑤調(diào)節(jié)膠原粗提液pH，加入中性鹽鹽析，離心獲得膠原蛋白沉淀；⑥加入磷酸鹽緩沖液溶解上述沉淀，獲得膠原蛋白原液。

作為對(duì)本發(fā)明所述的一種基于膠原蛋白的軟骨再生載體的制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)：所述濃度配制的步驟如下：稱取一定質(zhì)量的膠原蛋白原液，調(diào)整濃度后獲得膠原蛋白溶液；攪拌膠原蛋白溶液至無顆粒,并調(diào)節(jié)pH至4.0～7.0之間。

作為對(duì)本發(fā)明所述的一種基于膠原蛋白的軟骨再生載體的制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)：所述膠原蛋白溶液的質(zhì)量濃度為6～20mg/ml。

作為對(duì)本發(fā)明所述的一種基于膠原蛋白的軟骨再生載體的制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)：膠原蛋白溶液調(diào)整步驟如下：在膠原蛋白原液中加入一定體積的酸，通過分散器分散2～10min；再次加入一定體積的酸，通過分散器分散1～10min。

作為對(duì)本發(fā)明所述的一種基于膠原蛋白的軟骨再生載體的制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)：膠原蛋白溶液攪拌步驟如下：通過攪拌機(jī)攪拌10～180min。

作為對(duì)本發(fā)明所述的一種基于膠原蛋白的軟骨再生載體的制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)：調(diào)節(jié)膠原蛋白溶液pH步驟中，采用2％～20％氫氧化鈉溶液、氫氧化鉀或碳酸氫鈉中的一種或幾種。

作為對(duì)本發(fā)明所述的一種基于膠原蛋白的軟骨再生載體的制備方法的進(jìn)一步改進(jìn)：所述酸為乙酸、檸檬酸、酒石酸或亞酒石酸。