[發明專利]一種膀胱內尿液細菌基因組DNA的提取方法

在審

• 申請號: 201910627000.7
• 申請日: 2019-07-12
• 公開（公告）號: CN110331140A
• 公開（公告）日: 2019-10-15
• 發明（設計）人: 柳豐萍;薛育政;朱升龍;孫仁娟;鄒葉青
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 南京正聯知識產權代理有限公司 32243
• 代理人: 張玉紅

本發明公開了一種膀胱內尿液細菌基因組DNA的提取方法，主要包括尿液樣品采集、離心提取沉淀物、細菌細胞的溶解、磁珠提取液提取DNA、磁珠提取液的洗脫、PCR擴增及產物的DNA電泳檢測等步驟。該方法是針對膀胱尿液中微生物含量低、現有的腸道樣品細菌DNA提取試劑盒在提取膀胱尿液DNA時無法提取足夠量的DNA以用于后續研究的現狀設計的，針對性強，步驟簡單易操作，提取效率高。

技術領域

本發明涉及DNA提取技術領域，具體是涉及一種膀胱內尿液細菌基因組DNA的提取方法。

背景技術

進行微生態研究的前提條件是成功提取樣品中微生物的DNA。膀胱這一機體部位一直一來都被人們視為是無菌的，然而，近年來科研人員通過恥骨上膀胱穿刺采集尿標本，并結合擴增培養的方式獲知膀胱其實和機體腸道、子宮、陰道等部位一樣，是可以培養出細菌的。擴增培養雖然較傳統的微生物學培養方法來說，可將培養成功率提高70%，但仍舊有培養失敗的可能性存在。

因此，如需對膀胱微生態結構進行充分了解，還需采用高通量測序技術對基因組進行細致全貌的分析。然而，高通量測序應用的先決條件是樣品中含有足夠量的細菌DNA用于后續測序。雖然膀胱中的尿液是有菌的，但其微生物含量非常低，用普通的腸道樣品細菌DNA提取試劑盒無法提取足夠量的DNA，導致研究工作或臨床檢測難以完成。因此，有必要針對該種情況設計一種專用于膀胱內尿液細菌基因組DNA的提取方法。

發明內容

本發明的目的在于解決現有技術中存在的不足，提供一種膀胱內尿液細菌基因組DNA的提取方法，提取效率高，保證后續研究工作的順利進行。

本發明的技術方案為：一種膀胱內尿液細菌基因組DNA的提取方法，具體包括如下步驟：

1.使用碘伏消毒會陰部和尿道外口，采用導尿術采集不少于40 mL尿液至50 mL無酶無DNA離心管中，以防止外源性污染，將尿液放在置有冰袋的泡沫盒內于半小時內送至實驗室；

2.從本步驟開始，所有操作在生物凈化臺內完成，將尿液放在高速低溫離心機內離心1小時，于15000×g條件下進行離心，溫度為4℃；

3.用5 mL移液槍及滅過菌的無菌槍頭吸去大部分上清液，僅留下沉淀物及底部約1.5mL的上清液，利用移液槍將余留的上清液和沉淀物吹打混勻，并移至1.5 mL無菌離心管中；

4.將上述1.5 mL離心管置于高速離心機內，于20000×g條件下進行離心，離心1小時，溫度為4℃；

5.移去上清液，保留沉淀物，將250 μL細菌細胞裂解液加在沉淀物中，吹打混勻，直至無可見團塊狀物質為止；

6.將上一步樣本置于60℃水浴箱中，水浴30分鐘，然后移于液氮中，保持30分鐘，此步驟循環不少于6次；

7.取上一步樣本120 μL至PCR管，再加磁珠提取液（Sera-MagTM SpeedBeadsCarboxylate-Modified Magnetic Particles）60 μL，反復吹打混勻，掌上離心機離心30秒后將PCR管放置在磁力架上保持10分鐘，吸去上清液，保留磁珠，掌上離心機離心30秒，再次吸去上清液；

8.在PCR管中加入磁珠洗脫液反復洗脫磁珠2次，吸去磁珠洗脫液，此步驟在磁力架上進行，掌上離心機離心30秒，再將PCR管置于磁力架上，吸去洗脫液；

9.加30 μL無菌去離子水至PCR管中，反復吹打混勻，直至無可見磁珠，此步驟不可在磁力架上進行；

10.將上一步樣本置于磁力架上，靜置10分鐘，吸去上清液，即DNA；

11. 對細菌16S rRNA基因V3-V4區域進行PCR擴增并對產物進行DNA電泳檢測。