[發(fā)明專利]一種膀胱內(nèi)尿液細(xì)菌基因組DNA的提取方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910627000.7
• 申請日: 2019-07-12
• 公開（公告）號: CN110331140A
• 公開（公告）日: 2019-10-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 柳豐萍;薛育政;朱升龍;孫仁娟;鄒葉青
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 南京正聯(lián)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32243
• 代理人: 張玉紅

1.一種膀胱內(nèi)尿液細(xì)菌基因組DNA的提取方法，其特征在于，具體包括如下步驟：

1）使用碘伏消毒會陰部和尿道外口，采用導(dǎo)尿術(shù)采集不少于40 mL尿液至50 mL無酶無DNA離心管中，以防止外源性污染，將尿液放在置有冰袋的泡沫盒內(nèi)于半小時(shí)內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室；

2）將尿液放在高速低溫離心機(jī)內(nèi)離心1小時(shí)，于15000×g條件下離心，溫度為4℃；

3）用5 mL移液槍及滅過菌的無菌槍頭吸去大部分上清液，僅留下沉淀物及底部1.5 mL的上清液，利用移液槍將余留的上清液和沉淀物吹打混勻，并移至1.5 mL無菌離心管中；

4）將上述1.5 mL離心管置于高速離心機(jī)內(nèi)，于20000×g條件下離心1小時(shí)，溫度為4℃；

5）移去上清液，保留沉淀物，將250 μL細(xì)菌細(xì)胞裂解液加在沉淀物中，吹打混勻，直至無可見團(tuán)塊狀物質(zhì)為止；

6）將上一步樣本置于60℃水浴箱中，水浴30分鐘，然后移于液氮中，保持30分鐘，此步驟循環(huán)不少于6次；

7）取上一步樣本120 μL至PCR管，再加磁珠提取液60 μL，反復(fù)吹打混勻，掌上離心機(jī)離心30秒后將PCR管放置在磁力架上保持10分鐘，吸去上清液，保留磁珠，掌上離心機(jī)離心30秒，再次吸去上清液；

8）在PCR管中加入磁珠洗脫液反復(fù)洗脫磁珠2次，吸去磁珠洗脫液，此步驟在磁力架上進(jìn)行，掌上離心機(jī)離心30秒，再將PCR管置于磁力架上，吸去洗脫液；

9）加30 μL無菌去離子水至PCR管中，反復(fù)吹打混勻，直至無可見磁珠，此步驟不可在磁力架上進(jìn)行；

10）將上一步樣本置于磁力架上，靜置10分鐘，吸去上清液，即DNA；

11）對細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對產(chǎn)物進(jìn)行DNA電泳檢測。

2.如權(quán)利要求1所述的一種膀胱內(nèi)尿液細(xì)菌基因組DNA的提取方法，其特征在于，從步驟2開始之后的所有操作均在生物凈化臺內(nèi)完成。

3.如權(quán)利要求1所述的一種膀胱內(nèi)尿液細(xì)菌基因組DNA的提取方法，其特征在于，步驟8中所用的磁珠洗脫液為80%乙醇+3%鹽酸的混合溶液。

4.如權(quán)利要求1所述的一種膀胱內(nèi)尿液細(xì)菌基因組DNA的提取方法，其特征在于，步驟7中吸去上清液的過程中槍頭不可觸碰磁珠。

5. 如權(quán)利要求1所述的一種膀胱內(nèi)尿液細(xì)菌基因組DNA的提取方法，其特征在于，步驟11中進(jìn)行PCR擴(kuò)增的引物為515F和806R，PCR反應(yīng)體系50 μL ，包括PCR Mix Buffer 25 μL，DMSO 3 μL，F(xiàn)/R引物各3 μL，gDNA 10 μL，去離心水6 μL，PCR反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性30 s→98℃變性15 s→58℃退火15 s→72℃延伸15 s，變性-延伸循環(huán)反應(yīng)30次→72℃終延伸1min→4℃保溫。