[發(fā)明專利]一種高效快速構(gòu)建豬腸道冠狀病毒重組病毒的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910626337.6
• 申請(qǐng)日: 2019-07-11
• 公開（公告）號(hào): CN110331171A
• 公開（公告）日: 2019-10-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 肖少波;方六榮;彭棋;王蕩;方譜縣;周艷榮;劉康
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/90
• 分類號(hào): C12N15/90;C12N15/85;C12N15/65;C12N15/50;C12R1/93
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 張紅兵

本發(fā)明屬于動(dòng)物傳染病防制技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種高效快速構(gòu)建豬腸道冠狀病毒重組病毒的方法。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)含有PEDV AJ1102株全長cDNA的BAC質(zhì)粒進(jìn)行切割，再通過同源重組方式獲得EGFP基因替換PEDV AJ1102株ORF3基因的重組BAC質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后拯救出重組病毒rAJ1102?△ORF3?EGFP。由于不同的豬腸道冠狀病毒具有相似的基因組結(jié)構(gòu)與復(fù)制策略，本發(fā)明也適合于其它豬腸道冠狀病毒重組病毒的構(gòu)建。與傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明具有靶點(diǎn)選擇寬泛，特異性強(qiáng)，操作簡單，效率高和實(shí)驗(yàn)周期短等突出優(yōu)點(diǎn)，在一周之內(nèi)便可獲得重組病毒，是一種高效快速構(gòu)建豬腸道冠狀病毒重組病毒的方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于動(dòng)物傳染病防制技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種高效快速構(gòu)建豬腸道冠狀病毒重組病毒的方法。

背景技術(shù)

冠狀病毒為單股正鏈RNA病毒，主要引起腸道和呼吸道感染，其中引起豬腸道感染的冠狀病毒主要有豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,簡稱PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,簡稱TGEV)、豬δ冠狀病毒(porcine deltacoronavirus,簡稱PDCoV)和豬腸道α冠狀病毒(porcine entericalphacoronavirus,簡稱PEAV)，這四種冠狀病毒均能引起仔豬嚴(yán)重的腹瀉，嚴(yán)重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。

冠狀病毒重組病毒的構(gòu)建往往是在獲得病毒的感染性克隆/反向遺傳操作系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，通過對(duì)靶基因進(jìn)行改造或插入外源基因后實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)前構(gòu)建豬腸道冠狀病毒反向遺傳系統(tǒng)的方法主要有四種：1)靶向RNA重組技術(shù)構(gòu)建病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)(Li C,etal.Manipulation of the porcine epidemic diarrhea virus genome using targetedRNA recombination.PLoS One.2013,8(8):e69997.)。該操作可實(shí)現(xiàn)冠狀病毒3’端結(jié)構(gòu)基因的自由改造，但無法對(duì)冠狀病毒5’端前2/3的復(fù)制酶基因區(qū)域的改造。2)利用細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosome,BAC)系統(tǒng)，將病毒全長基因組克隆至BAC載體中構(gòu)建反向遺傳操作系統(tǒng)(Gonzalez J,et al.Stabilization of a full-lengthinfectious cDNA clone of transmissible gastroenteritis coronavirus byinsertion of an intron.Journal of Virology.2002,76(9),4655-61；Almazan F,etal.Engineering infectious cDNAs of coronavirus as bacterial artificialchromosomes.Methods Mol Biol.2015,1282:135-152；Li J,et al.Development of thefull-length cDNA clones of two porcine epidemic diarrhea disease virusisolates with different virulence.PLoS One.2017,12(3):e0173998.)。該方法不涉及到體外連接和轉(zhuǎn)錄，且重組病毒的拯救效率高。3)利用體外cDNA連接的方法構(gòu)建病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)(Yount,B,et al.Strategy for systematic assembly of large RNAand DNA genomes:transmissible gastroenteritis virus model.Journal ofVirology.2000,74(22):10600-11；Beall A,et al.Characterization of a pathogenicfull-Length cDNA clone and transmission model for porcine epidemic diarrheavirus strain PC22A.MBio.2016,7(1):e01451-15.)。該方法可利用II型限制性內(nèi)切酶將病毒的多個(gè)cDNA片段一次性連接起來，再利用T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄獲得全長RNA，電轉(zhuǎn)至敏感細(xì)胞系，拯救出重組病毒。用該方法進(jìn)行病毒拯救通常需要同時(shí)電轉(zhuǎn)相應(yīng)病毒的N基因轉(zhuǎn)錄本以提高其拯救效率，同時(shí)，T7RNA聚合酶在工作時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生突變，這在一定程度上影響了該方法的拯救效率。4)利用痘苗病毒作為載體構(gòu)建病毒的感染性克隆(Thiel V andSiddell SG.Reverse genetics of coronaviruses using vaccinia virusvectors.Curr Top Microbiol Immunol.2005,287:199-227；van den Worm SH,etal.Reverse genetics of SARS-related coronavirus using vaccinia virus-basedrecombination.PLoS One.2012,7(3):e32857)。痘病毒載體攜帶的是T7RNA聚合酶系統(tǒng)，可以通過體外轉(zhuǎn)錄RNA再轉(zhuǎn)染的方式拯救病毒，也可以直接轉(zhuǎn)染表達(dá)T7RNA聚合酶的細(xì)胞系來完成拯救。轉(zhuǎn)染前細(xì)胞需要先感染禽痘病毒輔助病毒，以提供痘病毒載體起始轉(zhuǎn)錄必要的組分(Casais et al.,Modular organization of SARS coronavirus nucleocapsidprotein.Journal of Biomedical Science.2001,13:59-72)。