[發明專利]一種高效快速構建豬腸道冠狀病毒重組病毒的方法

在審

• 申請號: 201910626337.6
• 申請日: 2019-07-11
• 公開（公告）號: CN110331171A
• 公開（公告）日: 2019-10-15
• 發明（設計）人: 肖少波;方六榮;彭棋;王蕩;方譜縣;周艷榮;劉康
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/85;C12N15/65;C12N15/50;C12R1/93
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 張紅兵

1.一種高效快速構建豬腸道冠狀病毒重組病毒的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)設計靶向豬流行性腹瀉病毒(PEDV)AJ1102株ORF3基因的兩個sgRNA，利用CRISPR/Cas9系統體外切割含有PEDV AJ1102株全長cDNA的BAC質粒pBAC-AJ1102；

(2)利用融合PCR擴增含有豬流行性腹瀉病毒AJ1102株ORF3基因上游序列、EGFP基因和PEDV AJ1102株ORF3基因下游序列的片段，該片段與切割后的pBAC-AJ1102上、下游各含有20bp的同源臂；

(3)用融合克隆重組酶將切割后的質粒pBAC-AJ1102與融合PCR產物以摩爾比為1:5的比例進行同源重組；

(4)將重組產物轉化至DH10B化學感受態細胞中，利用PCR篩選陽性克隆，并對PCR產物進行測序；

(5)將測序正確的陽性克隆擴大培養后大量提取質粒；

(6)將提取的質粒用Lipofectamine 3000轉染至Vero細胞，轉染6h后，換上含有10μg/mL胰酶的無血清DMEM培養基，逐日觀察細胞病變，

其中步驟(2)中所述的ORF3基因上游序列，EGFP基因和ORF3基因下游序列的核苷酸序列分別如下所示：

ORF3基因上游序列：

AGAGGCTATTAGTCAAACTTCTAAGGGTTTGAACACTGTGGCTCATGCGCTTACCAAGGTCCAAGAGGTTGTTAATTCGCAGGGTGCAGCTTTGACCCAACTTACCGTACAGCTGCAACACAACTTCCAAGCCATTTCTAGTTCTATTGATGACATTTACTCCCGACTTGACATTCTTTCAGCCGATGTTCAGGTAGACCGTCTCATCACCGGCAGATTATCAGCACTTAATGCTTTTGTTGCTCAAACCCTTACTAAGTATACTGAGGTTCAGGCTAGCAGGAAACTAGCACAGCAAAAGGTTAATGAGTGCGTTAAATCGCAATCTCAGCGTTATGGTTTTTGTGGTGGTGATGGCGAGCACATTTTCTCTCTGGTACAGGCCGCACCTCAAGGCCTGCTGTTTTTACACACAGTACTTGTACCGGGTGACTTTGTAAATGTTATTGCCATCGCTGGCTTATGTGTTAACGATGAAATTGCCTTGACTCTACGTGAGCCTGGTTTAGTCTTGTTTACGCATGAACTTCAAGATACTGCGACGGAATATTTTGTTTCATCGCGACGTATGTATGAACCTAGAAAACCTACCGTTGGTGATTTTGTTCAAATTGAGAGTTGTGTGGTCACCTATGGCAATTTGACTAGAGACCAACTACCAGAAGTAATCCCAGATTACATCGATGTTAACCAAACACTTGATGAGATTTTAGCTTCTCTGCCCAATAGAACTGGTCCAAGTCTTTCTCTAGATGTTTTTAATGCCACTTATCTTAATCTTACTGGTGAAATTGCAGATTTAGAGCAGCGTTCAGAGTCTCTCCGTAATACTACAGAAGAGCTTCAAAGTCTTATATATAATATCAACAACACACTAGTTGACCTTGAGTGGCTCAACCGAGTTGAGACATATATCAAGTGGCCGTGGTGGGTTTGGTTGATTATTTTTATTGTTCTCATCTTTGTTGTGTCATTACTAGTGTTCTGCTGCATTTCCACGGGTTGTTGTGGATGCTGCGGCTGCTGTGGTGCTTGTTTTTCAGGTTGTTGTAGGGGTCCTAGACTTCAACCTTACGAAGCTTTTGAAAAGGTCCACGTGCAGTG；

EGFP基因：

GAAAAGGTCCACGTGCAGTGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA；

ORF3基因下游序列：

TGGACGAGCTGTACAAGTAAGATTCAATTCAACTAGACGAGTATGCTACAATTAGTGAATGATAATGGTCTAGTAGTTAATGTTATACTTTGGCTTTTCGTACTCTTTTTCCTGCTTATTATAAGCATTACTTTCGTCCAATTGGTTAATCTGTGCTTCACTTGTCACCGGTTGTGTAATAGCGCAGTTTACACACCTATAGGGCGTTTGTATAGAGTTTATAAGTTTTACATGCAAATTGACCCCCTCCCCAGTACTGTTATTGACGTATAAACGAAATATGTCTAACGGTTCTATTCCCGTTGATGAGGTGATTGAACACCTTAGAAACTGGAATTTCACATGGAATATCATACTGACGATACTACTTGTAGTGCTTCAGTATGGCCATTACAAGTACTCTGCGTTCTTGTATGGTGTCAAGATGGCTATTCTATGGATACTTTGGCCTCTTGTGCTGGCACTTTCACTTTTTGATGCATGGGCTAGCTTTCAGGTCAACTGGGTCTTTTTTGCTTT。