[發明專利]一種適應于魚類原肌球蛋白純化的瓊脂糖硼酸親和材料的制備方法

有效

• 申請號: 201910614901.2
• 申請日: 2019-07-08
• 公開（公告）號: CN110711571B
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發明（設計）人: 曹立民;殷佳珞;鄭洪偉;林洪;隋建新;王博成
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: B01J20/285
• 分類號: B01J20/285;B01D15/38;C07K14/46;C07K1/22
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 尉偉敏;何俊

本發明涉及分離技術領域，公開了一種適應于魚類原肌球蛋白純化的瓊脂糖硼酸親和材料的制備方法，本發明以3,5?二氟?4?甲?；脚鹚釣楣δ軉误w，三（2?氨基乙基）胺為多支化配體，瓊脂糖微球為基質材料，制備了一種新的瓊脂糖硼酸親和材料，并將其首次用于魚類原肌球蛋白的分離純化中，并用不同的魚類樣品確定了最佳使用條件。結果顯示，當瓊脂糖濃度為3％，上樣平衡液pH為7.4，HAc洗脫液濃度為100mM時，所得原肌球蛋白純度在90%以上，柱容量約為1.85mg/mL以上。與傳統方法相比，此技術可以顯著縮短純化時間（從數天縮減至3?4h），且不使用有機溶劑，產物純度與傳統方法相當。

技術領域

本發明涉及分離技術領域，尤其涉及一種適應于魚類原肌球蛋白純化的瓊脂糖硼酸親和材料的制備方法。

背景技術

食物過敏問題是目前公共衛生安全的主要問題之一，據WHO/IUIS過敏原數據庫統計，原肌球蛋白是許多無脊椎動物(如：蝦、蟹、貝類)中的主要過敏原。然而，近幾年來，一些魚類(如：羅非魚、安康魚、藍鰭金槍魚、長鰭金槍魚、斑馬魚等)中的原肌球蛋白也被報道具有致敏性，被認為是一種潛在的過敏原，從而引起了人們的廣泛關注。因此，深入了解原肌球蛋白在魚類及其他水產品中的致敏機制，合理監測和標注不同食品中的原肌球蛋白，對有效控制原肌球蛋白引發的過敏性安全問題來說極為重要。

高效的分離、純化對于了解原肌球蛋白的物理、化學和生物特性具有十分重要的意義，這也是建立諸如各種免疫測定等分析技術的關鍵過程。目前常用的提取純化原肌球蛋白的方法主要可分為以下幾個步驟：首先，使用有機試劑提取以獲得蛋白質粗提液，然后以蛋白質粗提液為原料，采用硫酸銨鹽析法或等電點沉淀法獲得原肌球蛋白粗品，最后通常會使用層析技術使原肌球蛋白得到進一步純化。傳統方法的樣品處理量較高，但是整個過程耗時較長(通常2-3天)、步驟較多，純化效果常常因多步操作而變得不穩定，而且有機試劑的使用會存在蛋白質變性的風險。因此，發展高效便捷的原肌球蛋白提取純化方法具有十分重要的意義。

硼親和(BA)技術是一種選擇性分離富集順式二羥基化合物有效的手段。主要基于硼親和材料與順式二羥化合物之間的可逆共價結合作用，其主要原理是利用硼酸在較高的pH環境下(通常pH≥8.5)與順式二羥基生物分子中的鄰二羥基發生共價反應生成五元或六元的環狀化合物；當環境切換為酸性時(通常pH＜3.0)，四面體型的硼原子轉化為平面型的硼原子，此時反應生成的環狀化合物發生解離，釋放出順式二羥基生物分子。

在硼親和材料的制備中材料基質的選擇較為關鍵，材料基質一般分為剛性無機介質和多糖軟質膠。剛性無機介質如硅膠、金屬氧化物、多孔玻璃等具有力學強度理想，柱效高等優點，目前已有報道顯示，古淑青等人已利用整體硅膠柱結合苯硼酸集團純化了巧克力中的花生、牛奶、大豆、堅果中的主要過敏原。但是，這類基質的非特異性吸附強，應用pH范圍較窄，生物相容性不佳，上述報道中用到的硼親和材料其上樣pH值較高(pH＝11)，在此pH環境中可能會導致蛋白質變性，大大限制了材料在生物樣本中的使用范圍。多糖軟質膠類包括瓊脂糖、纖維素、葡聚糖等，其中瓊脂糖因其具有理化穩定性、易于修飾性、低毒性及生物相容性，是應用較廣泛的一類分離介質。

本申請人的在先專利CN201811039827.8公開了一種聚乙烯亞胺超支化瓊脂糖基硼親和材料的制備方法及其應用，制備方法包括：1)瓊脂糖微球的制備；2)環氧化瓊脂糖的制備；3)環氧化瓊脂糖的氨基化修飾；4)苯硼酸瓊脂糖的制備。該發明制備的基于瓊脂糖基的高柱容量高生物相容性硼親和材料，其中瓊脂糖被選作為基架，聚乙烯亞胺作為超支化配基進行修飾，同時3，5-二氟-4-甲?；脚鹚嶙鳛橛H和基團。該發明克服了一系列技術問題，成功將硼親和材料應用于細胞水平的識別與分離。但是該方法制備所得的親和材料只是適用于細菌的分離，將其用于魚類原肌球蛋白純化并不能獲得理想的效果。原因在于該材料選用聚乙烯亞胺作為超支化配基，以期增加苯硼酸的修飾率，提高細菌的富集量，但是與本發明方法中所用的(三(2-氨基乙基)胺相比，修飾完成后的材料表面會有更多裸露氨基，將其應用在復雜魚類樣本原肌球蛋白的純化中，會造成大量非特異性吸附，不能得到較高純度的原肌球蛋白。綜上，有必要開發出中一種專用于魚類原肌球蛋白純化的親和材料。