[發(fā)明專利]一種適應(yīng)于魚類原肌球蛋白純化的瓊脂糖硼酸親和材料的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910614901.2
• 申請日: 2019-07-08
• 公開（公告）號: CN110711571B
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曹立民;殷佳珞;鄭洪偉;林洪;隋建新;王博成
• 申請（專利權(quán)）人: 中國海洋大學(xué)
• 主分類號: B01J20/285
• 分類號: B01J20/285;B01D15/38;C07K14/46;C07K1/22
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務(wù)所有限公司 33109
• 代理人: 尉偉敏;何俊

1.一種適應(yīng)于魚類原肌球蛋白純化的瓊脂糖硼酸親和材料的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

1）瓊脂糖微球的制備：將濃度為1.5-4wt%的瓊脂糖水溶液加熱至完全溶解作為水相；按14-18 g/400 mL的比例將司盤80 加入到液體石蠟中，在75-85℃恒溫水浴中攪拌均勻后作為油相；在持續(xù)攪拌下，按體積比1:6-6.5將水相加入油相，隨后冷卻至室溫，并持續(xù)攪拌使微球成型；將所得微球分別用石油醚、異丙醇及超純水于布氏漏斗中真空抽洗，得到瓊脂糖微球，置于乙醇溶液中保存?zhèn)溆茫?/p>

2）瓊脂糖微球的環(huán)氧化：以5 g瓊脂糖微球計，稱取5 g瓊脂糖微球置于容器中，加入0.8-1.0 mol/L NaOH 45-55 mL；0.4-0.6 g/L NaBH₄ 45-55 mL 以及35-45 mL環(huán)氧氯丙烷，于35-45℃下震蕩活化3-5h，隨后置于布氏漏斗中，用去離子水真空抽濾沖洗至中性，沖洗液加入硫代硫酸鈉以及酚酞不顯色為止，制得環(huán)氧化瓊脂糖微球；

3）環(huán)氧化瓊脂糖微球的氨基化：以5 g環(huán)氧化瓊脂糖微球計，取5 g環(huán)氧化瓊脂糖微球與1.8-2.2 mL三(2-氨基乙基)胺和18-22mL乙腈充分混合，在55-65℃下攪拌進行氨基化反應(yīng)10-14h，得到氨基化瓊脂糖微球；

4）瓊脂糖硼酸親和材料的制備：以3 g氨基化瓊脂糖微球計，將步驟3）所得3 g氨基化瓊脂糖微球分別用甲醇和乙腈沖洗；隨后取18-22 mL甲醇與氨基化瓊脂糖微球混合，超聲后依次加入290-310 mg 3,5-二氟-4-甲酰基苯硼酸和580-620 mg氰基硼氫化鈉，常溫下攪拌反應(yīng)2.5-3.5d，所得產(chǎn)物在抽濾裝置中用無水甲醇，4-6wt%碳酸氫鈉，4-6wt%氯化鈉和去離子水沖洗。

2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟1）中，所述瓊脂糖水溶液的濃度為3wt%。

3.如權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于：步驟1）中，第一次持續(xù)攪拌的轉(zhuǎn)速為800-1200 rpm；第二次持續(xù)攪拌的轉(zhuǎn)速為600-1000 rpm，第二次攪拌時間3-7min。

4.如權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于：步驟1）中，所述石油醚、異丙醇及超純水的用量比為(2-4):(2-4):(3-5)；所述乙醇溶液的濃度為15-25wt%，保存?zhèn)溆脺囟葹?-5℃。

5.如權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于：步驟2）中，所述NaBH₄濃度為0.5 g/L，NaOH濃度為0.9 mol / L，環(huán)氧氯丙烷的添加量為40mL，震蕩活化時間為4h。

6.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟4）中，將所得3 g氨基化瓊脂糖微球分別用甲醇和乙腈沖洗；隨后取18-22 mL甲醇與氨基化瓊脂糖微球混合，超聲后依次加入290-310 mg 3,5-二氟-4-甲酰基苯硼酸和580-620 mg氰基硼氫化鈉，常溫下攪拌反應(yīng)2.5-3.5d，隨后加入1.5-2.5 mL甲醛溶液及450-550 mg氰基硼氫化鈉，常溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng)46-50 h，所得產(chǎn)物在抽濾裝置中用無水甲醇，4-6wt%碳酸氫鈉，4-6wt%氯化鈉和去離子水沖洗。

7.如權(quán)利要求1或6所述的制備方法，其特征在于：步驟4）中，所述甲醇和乙腈的用量均為35-45mL；所述無水甲醇、碳酸氫鈉、氯化鈉和去離子水的用量為35-45mL、18-22mL、18-22mL和27-33mL。