[發明專利]一種基于人源TLR4基因的多功能雙熒光素酶報告基因載體及其構建方法與應用

在審

• 申請號: 201910609302.1
• 申請日: 2019-07-08
• 公開（公告）號: CN110343713A
• 公開（公告）日: 2019-10-18
• 發明（設計）人: 鄭冰蓉;陳國棟;楊璐涵;司維;王峻峰
• 申請（專利權）人: 云南大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/12;C12N15/66;C12N15/65;C12Q1/66
• 代理公司: 北京市盈科律師事務所 11344
• 代理人: 羅東

本發明公開了一種基于人源TLR4基因的多功能雙熒光素酶報告基因載體及其構建方法與應用，屬于分子遺傳學領域。本發明多功能雙熒光素酶報告基因載體為pGLTlr4/?3494+235/3UTR，載體的DNA序列如SEQ ID NO.5所示；多功能雙熒光素酶報告基因載體包含人源TLR4基因?3494至+235序列和完整3'?UTR序列，人源TLR4基因?3494至+235序列如SEQ ID NO:1所示，完整3'?UTR序列如SEQ ID NO:2所示；人源TLR4基因?3494至+235序列和3'?UTR完整序列分別克隆于pGL3?Basic質粒中螢火蟲熒光素酶luc基因的上游和下游。本發明將TLR4基因上下游非編碼序列分別無縫克隆至螢火蟲熒光素酶luc基因的上下游，使得載體的結構組成比傳統熒光素酶報告質粒更加接近體內真實情況，有效避免外源啟動子對實驗結果的負面影響。

技術領域

本發明公開了一種基于人源TLR4基因的多功能雙熒光素酶報告基因載體及其構建方法與應用，屬于分子遺傳學領域。

背景技術

Toll樣受體(Toll-Like receptor，TLRs)是模式識別受體(pattern recognitionreceptor,PRRs)，是炎癥信號傳遞的門戶蛋白，在生理狀態下與其對應的配體結合后會引發細胞信號轉導，引起下游多種與炎癥反應相關基因的高表達，促進多種炎性細胞因子的釋放，從而在對抗入侵病原體的過程中起到了至關重要的作用，能夠有效激活天然免疫和獲得性免疫應答。其中，TLR4是第一個被發現的Toll樣受體蛋白，屬于I型跨膜蛋白，它由胞外的氨基端、跨膜區以及胞內的羧基端三部分組成，大量表達在抗原提呈細胞的表面。大量研究發現，TLR4參與生物體內的多種炎癥調節、免疫應答以及腫瘤發生的進程，與許多疾病的發生發展過程密切相關。TLR4受體激活引發的下游炎癥級聯反應往往會使疾病向不利的方向轉化，雖然目前有大量研究工作著落在阻斷或抑制TLR4信號通路各個節點基因表達上，但是目前仍然沒有研發出特別有效的藥物或治療方法能夠精準靶向TLR4信號通路而達到確切治療疾病的目的。因此，深入研究TLR4基因表達調控機制實乃當務之急。

非翻譯區(Untranslated Region,UTR)，是指位于mRNA鏈編碼區兩端不翻譯為蛋白質的片段，位于編碼區上游的mRNA片段被稱為5'非翻譯區(5'-untranslated region，5'-UTR)，位于編碼區下游則被稱為3'非翻譯區(3'-untranslated region，3'-UTR)。大量研究表明非翻譯區密切調控基因轉錄前和轉錄后的表達，5'非翻譯區能夠影響基因的mRNA的翻譯效率、穩定性以及出核轉運，從而導致蛋白表達水平的改變；3'非翻譯區則主要影響mRNA的穩定性和翻譯。其中，miRNA靶向結合至3'-UTR而負調控目的基因表達水平為近年來非編碼區調控研究的一大熱點。2017年，斯坦福大學Jin Billy Li課題組和中山大學張銳課題組共同報道了3'-UTR的編輯位點可能通過介導mRNA的降解來調控基因表達，這一研究對認識RNA編輯的進化和功能提供了新思路，特別是揭示了非編碼區RNA編輯位點的功能重要性。此外，大量研究報道大量分布在非翻譯區的單核苷酸多態性(Single NucleotidePolymorphism，SNP)位點能夠影響基因的表達量，從而與腫瘤、免疫性疾病和心血管疾病等密切相關。