[發(fā)明專利]一種基于人源TLR4基因的多功能雙熒光素酶報告基因載體及其構建方法與應用

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• 申請日: 2019-07-08
• 公開（公告）號: CN110343713A
• 公開（公告）日: 2019-10-18
• 發(fā)明（設計）人: 鄭冰蓉;陳國棟;楊璐涵;司維;王峻峰
• 申請（專利權）人: 云南大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/12;C12N15/66;C12N15/65;C12Q1/66
• 代理公司: 北京市盈科律師事務所 11344
• 代理人: 羅東

1.一種基于人源TLR4基因的多功能雙熒光素酶報告基因載體，其特征在于：多功能雙熒光素酶報告基因載體為pGLTlr4/-3494+235/3UTR，載體的DNA序列如SEQ ID NO.5所示。

2.權利要求1所述基于人源TLR4基因的多功能雙熒光素酶報告基因載體，其特征在于：多功能雙熒光素酶報告基因載體包含人源TLR4基因-3494至+235序列和完整3'-UTR序列，人源TLR4基因-3494至+235序列如SEQ ID NO:1所示，完整3'-UTR序列如SEQ ID NO:2所示。

3.權利要求2所述基于人源TLR4基因的多功能雙熒光素酶報告基因載體，其特征在于：人源TLR4基因-3494至+235序列和3'-UTR完整序列分別克隆于pGL3-Basic質粒中螢火蟲熒光素酶luc基因的上游和下游。

4.基于人源TLR4基因的多功能雙熒光素酶報告基因載體的構建方法，其特征在于，具體步驟如下：

(1)設計5'端包含接口上下游序列同源臂的引物對TPprimer1/TPprimer2和TPprimer3/TPprimer4，TPprimer1的DNA序列如SEQ ID NO.6所示，TPprimer2的DNA序列如SEQ ID NO.7所示，TPprimer3的DNA序列如SEQ ID NO.8所示，TPprimer4的DNA序列如SEQID NO.9所示；

(2)以人基因組DNA為模板，利用引物對TPprimer1/TPprimer2擴增出TLR4基因-3494至+235序列，利用引物對TPprimer3/TPprimer4擴增出完整3'-UTR序列，TLR4基因-3494至+235序列如SEQ ID NO:1所示，完整3'-UTR序列如SEQ ID NO:2所示；

(3)使用限制性內切酶NcoI和XbaI雙酶切pGL3-Basic質粒，通過瓊脂糖凝膠對酶切產物片段1和片段2純化回收，利用Gibson組裝方法將TLR4基因-3494至+235序列、完整3'-UTR序列、回收片段1和片段2進行同源組裝；

(4)將組裝產物轉入感受態(tài)細胞中，挑取單克隆進行電泳驗證、酶切驗證和測序鑒定，得到載體pGLTlr4/-3494+235/3UTR即基于人源TLR4基因的多功能熒光素酶報告基因載體，載體的DNA序列如SEQ ID NO.5所示。

5.權利要求4所述基于人源TLR4基因的多功能雙熒光素酶報告基因載體的構建方法，其特征在于：步驟(1)引物TPprimer1的5'端和步驟(3)片段2的3'端具有25bp的同源序列；步驟(1)引物TPprimer2的5'端和步驟(3)中片段1的5'端具有26bp的同源序列；步驟(1)引物TPprimer3的5'端和步驟(3)中片段1的3'端具有30bp的同源序列；步驟(1)引物TPprimer4的5'端和步驟(3)中片段2的5'端具有28bp的同源序列。

6.權利要求4所述基于人源TLR4基因的多功能雙熒光素酶報告基因載體的構建方法，其特征在于：片段1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，片段2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

7.權利要求4所述基于人源TLR4基因的多功能雙熒光素酶報告基因載體的構建方法，其特征在于：步驟(3)使用限制性內切酶NcoI和XbaI雙酶切pGL3-Basic質粒的酶切體系為10×M Buffer 4μl、pGL3-Basic質粒(250ng/μl)8μl、0.1％BSA 4μl、NcoI 2μl、XbaI 2μl、ddH₂O 20μl。

8.權利要求1～3任一項所述基于人源TLR4基因的多功能雙熒光素酶報告基因載體在檢測候選miRNAs對TLR4表達的調控活性中的應用。

9.權利要求1～3任一項所述基于人源TLR4基因的多功能雙熒光素酶報告基因載體在檢測SNP位點對TLR4基因表達影響中的應用。

10.權利要求1～3任一項所述基于人源TLR4基因的多功能雙熒光素酶報告基因載體在人類TLR4基因啟動子分析中的應用。