[發明專利]一種牙髓干細胞制備方法

有效

• 申請號: 201910606448.0
• 申請日: 2019-07-05
• 公開（公告）號: CN110468098A
• 公開（公告）日: 2019-11-19
• 發明（設計）人: 張彥茹;黃宇;唐雯
• 申請（專利權）人: 北京中瑞聯合生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 11210 北京紐樂康知識產權代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 劉艷艷<國際申請>=<國際公布>=<進入

本發明公開了一種牙髓干細胞制備方法,包括如下步驟：牙髓的運輸，取乳牙放入取樣瓶中，把取樣瓶及醫用冰袋放回運輸箱中運回實驗室；牙髓干細胞的分離，用鑷子夾住牙齒冠部，再用注射器吸取生理鹽水從牙根斷面向里吹打牙髓腔，沖洗松動牙髓；使用拔髓針取出牙髓；牙髓干細胞的擴增培養，取完全培養基，重懸牙髓沉淀，并轉移到12孔板中；用一個拔髓針固定牙髓，用另一個拔髓針上的倒鉤剝離牙髓，使牙髓形成細小碎片，釋放其中的細胞，然后培養。該制備方法使用拔髓針對凝聚的牙髓進行剝離,釋放其中的干細胞，避免使用膠原酶酶等對牙髓干細胞的損傷，可以排除消化過程對牙髓干細胞的損傷，使牙髓干細胞提取成功率達到100%，應用簡單方便。

技術領域

本發明涉及細胞生命科學技術領域，具體來說，涉及一種牙髓干細胞制備方法。

背景技術

牙髓干細胞（DPSC）是存在于牙髓組織中的一種間充質干細胞，獲取方便，可從更換的乳牙中獲取，不會給供體部位帶來功能及健康方面的損害，其在體外培養增殖能力強，擁有干細胞所具有的多項性能，在不同誘導條件下可向成骨細胞、脂肪細胞、神經細胞、內皮細胞等方向分化。有研究將DPSC與骨髓間充質干細胞進行比較，結果發現，它們具有相似的免疫表型，但牙髓干細胞具有更高的克隆形成率和增殖率，且表現出很強的鈣化組織形成能力。尤其是DPSC低表達MHC-Ⅱ類分子等，具有低免疫原性和免疫耐受作用，使其能逃逸免疫監控，可以使其作為自體或異體組織工程種子細胞。因此，DPSC作為組織再生及細胞治療的種子細胞，在自體或異體牙髓／牙本質再生、牙周病、組織工程骨、神經損傷等細胞治療應用中具有廣闊前景。

雖然牙髓干細胞在再生醫學領的巨大潛能受到越來越多人的關注，但是其在臨床前研究和應用中的問題也不斷展現：成功率低，牙齒從離體后，因運輸溫度波動大，運輸液營養條件缺乏、口腔微生物感染等，導致牙髓干細胞在運輸過程大量死亡，此外，牙髓干細胞本身含量少，現有分離體系較多以酶消化牙髓為主，對細胞損傷較大，后期培養過程中經常導致老化、凋亡或分化情況發生，導致牙髓干細胞培養成功率低，到目前為止，大多數分離、擴增方法還不能完全令人滿意。

發明內容

針對相關技術中的上述技術問題，本發明提出一種牙髓干細胞制備方法，能夠克服現有技術的上述不足。

為實現上述技術目的，本發明的技術方案是這樣實現的：

一種牙髓干細胞制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）牙髓的運輸，把牙髓干細胞的運輸箱交于供者，供者接收到運輸箱后，把運輸箱中的取樣瓶放至冷藏冰箱，醫用冰袋放至冷凍冰箱，供者乳牙自行脫落后，采取乳牙放入取樣瓶中，把取樣瓶及醫用冰袋放回運輸箱中，24小時內運回實驗室；

（2）牙髓干細胞的分離，把乳牙從取樣瓶取出，用生理鹽水清洗乳牙后，用鑷子夾住牙齒冠部，再用注射器吸取生理鹽水從牙根斷面向里吹打牙髓腔，沖洗松動牙髓；使用拔髓針從牙根斷處插入牙髓腔中，慢慢擰動，向外輕拉，取出牙髓，放至離心管中，用注射器重新吸取生理鹽水，沖洗牙髓腔一次，收集兩次沖洗牙髓腔的生理鹽水加入放置牙髓的離心管中，離心去除生理鹽水，收集牙髓；

（3）牙髓干細胞的擴增培養，取完全培養基，重懸牙髓沉淀，并轉移到12孔板中；用一個拔髓針固定牙髓，用另一個拔髓針上的倒鉤剝離牙髓，使牙髓形成細小碎片，釋放其中的細胞，然后放在37℃、5％ CO₂、飽和濕度條件下培養。

進一步的，步驟（1）中所述取樣瓶內放置有運輸液，所述運輸液配方為每100ml含有:注射用葡萄糖鈣0.1ml、注射用人血白蛋白5ml、注射用右旋糖苷40葡萄糖注射液44.9ml，注射用三磷酸腺苷50ml，青霉素鈉2萬單位，硫酸鏈霉素2萬單位。

進一步的，步驟（3）中，使用拔髓針上的倒鉤把牙髓剝離為1-2mm³細小碎片。

進一步的，步驟（3）中，培養2天后，用新鮮培養基進行半量換液，繼續誘導培養，每隔2天半量換液一次。