[發明專利]通過功能結構域嫁接提高聚合酶大片段活性的方法及應用

在審

• 申請號: 201910604380.2
• 申請日: 2019-07-05
• 公開（公告）號: CN112175091A
• 公開（公告）日: 2021-01-05
• 發明（設計）人: 任黎明;陳臻;段海峰
• 申請（專利權）人: 賽納生物科技(北京)有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N9/12;C12N15/62;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京嘉途睿知識產權代理事務所(普通合伙) 11793
• 代理人: 彭成

本發明公開了一種通過功能結構域嫁接提高聚合酶大片段活性的方法：將Sso7d DNA結合蛋白的基因(如SEQ ID NO.1所示)與野生型Bst DNA聚合酶大片段的基因連接(如SEQ ID NO.2所示)，得到的基因序列如SEQ ID NO.5所示，并轉入原核表達載體進行表達、純化，得到了重組的Bst DNA聚合酶大片段：Sso7d?Bst DNA聚合酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。通過反應速率檢測結果顯示：Sso7d?Bst DNA聚合酶大片段較野生型的Bst DNA聚合酶大片段反應速率提高。

技術領域

本發明涉及一種通過功能結構域嫁接的方法提高嗜熱脂肪土芽孢桿菌屬(Geobacillus stearothermophilus)DNA聚合酶大片段即Bst DNA聚合酶大片段對底物親和力的方法及應用，屬于分子生物學、蛋白質工程、酶工程領域。

背景技術

DNA聚合酶，又稱DNA依賴的DNA聚合酶(DNA dependent DNA polymerase)，它是以親代DNA為模板，催化底物dNTP分子聚合形成子代DNA的一類酶，廣泛存在于原核生物和真核生物中，是基因復制的基礎，是維持機體基因組穩定和完整遺傳的關鍵。DNA聚合酶有三種功能：①聚合作用：在引物3'-OH末端，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令，即A與T，C與G的配對原則，逐步逐個、連續地將dNTP加到延伸中的DNA分子3'-OH末端，逐步合成延長中的子鏈DNA。這是DNA聚合酶的主要作用；②3’→5’外切酶活性(校對作用)：從3’→5’方向識別和切除不配對的子鏈DNA末端的核苷酸，主要功能是校對作用，保證復制過程的保真性和準確性；③5’→3’外切酶活性(切除修復作用)：從5’→3’方向水解DNA延長鏈前方的DNA鏈(即只對DNA上雙鏈處的磷酸二酯鍵有切割作用)，產生5'—脫氧核苷酸。這種酶活性在DNA損傷的修復中可能起著重要作用。

嗜熱脂肪土芽孢桿菌屬(Geobacillus stearothermophilus)DNA聚合酶，即BstDNA聚合酶，基因全長2631bp，氨基酸序列全長876aa，Bst DNA聚合酶大片段是Bst DNA聚合酶第291位氨基酸至876位氨基酸序列酶，其不具有Bst DNA聚合酶5’→3’外切酶活性(切除修復作用)，無水解母鏈DNA分子5’端的單核苷酸，因其繼承了5’端的單核苷酸的鏈置換反應、高保真、耐高溫等特點，而成為一種重要的商用DNA多重置換擴增酶。

Sso7d是一種來源于嗜熱硫化裂片菌(Sulfolobus solfataricus)的雙鏈DNA結合蛋白，分子量為7kd，可非特異性的結合雙鏈DNA片段，結合后會產生不可預料的效果(或降低活性，或提高活性，或滅活，或無變化)。本發明嘗試將Sso7d、Sso7a、Sso7c3、Sso7c4系列雙鏈DNA結合蛋白的DNA結合結構域與Bst DNA聚合酶大片段融合，旨在提高Bst DNA聚合酶大片段的反應速率。

單鏈結合蛋白(Single Strand Binding protein，SSB)又稱DNA結合蛋白，其功能在于非特異性的和單鏈DNA結合，穩定解開的DNA單鏈，阻止復性和保護單鏈部分不被核酸酶水解，主要參與DNA復制、修復和重組。單鏈結合蛋白是177個氨基酸組成的蛋白，發揮功能是以四聚體的形式與單鏈DNA結合，并和其他單鏈結合蛋白四聚體、相鄰單鏈DNA結合，被結合的單鏈DNA是呈伸展狀態的，這種功能有利于以單鏈DNA作為模板進行的核酸擴增。因此，將單鏈結合蛋白與Bst DNA聚合酶大片段共價連接或許可以提高DNA聚合酶對底物的親和力，以提高反應速率。

發明內容