[發(fā)明專利]一種耳聾模型豬的重構(gòu)卵及其構(gòu)建方法，耳聾模型豬、構(gòu)建方法及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910603387.2
• 申請日: 2019-07-05
• 公開（公告）號: CN110468154A
• 公開（公告）日: 2019-11-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曹新;姚俊;曾華沙;楊海元;王盈;邢光前;陳智斌;魏欽俊;魯雅潔;戴一凡
• 申請（專利權(quán)）人: 南京醫(yī)科大學(xué);江蘇省人民醫(yī)院(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C12N9/22;C12N15/877;C12N5/10;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 32237 江蘇圣典律師事務(wù)所
• 代理人: 胡建華<國際申請>=<國際公布>=<進(jìn)入

本發(fā)明公開了一種耳聾模型豬的重構(gòu)卵及其構(gòu)建方法，并公開了了一種耳聾模型豬、構(gòu)建方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的耳聾模型豬的重構(gòu)卵及其構(gòu)建方法和模型豬的構(gòu)建方法通過敲除豬OSBPL2基因獲得了耳聾小型豬的重構(gòu)卵，結(jié)合CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)、體細(xì)胞核移植技術(shù)和胚胎移植技術(shù)，證明該方法用于構(gòu)建基因修飾的耳聾豬模型的高效性與可行性。通過該方法可以精確復(fù)制人OSBPL2基因突變的基因型和耳聾表型，獲得的OSBPL2基因敲除豬具有典型的人類常染色顯性遺傳性耳聾(DFNA67)的特征，可為人類遺傳性耳聾的疾病研究提供可靠的大動物模型，并可應(yīng)用于內(nèi)耳的基因修復(fù)、內(nèi)耳毛細(xì)胞再生與聽力重建等。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種耳聾模型豬的重構(gòu)卵及其構(gòu) 建方法，耳聾模型豬、構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

耳聾是最常見的感知性障礙疾病，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)最新統(tǒng)計，全球聽力殘疾人口約4.66億，其中近3400萬為兒童，新生兒耳聾發(fā)病率為0.1-0.3％。50％的耳聾患者發(fā)病與遺傳因素有關(guān)，根據(jù)是否伴有耳外組織異常、病變或系統(tǒng)性疾病，遺傳性耳聾分為 綜合征型耳聾(Syndromic Hearing Loss,SHL)和非綜合型耳聾(Non-syndromic HearingLoss,NSHL)，NSHL約占70％。常染色體顯性遺傳性耳聾(DFNA)和常染色體隱性遺傳性 耳聾(DFNB)是NSHL最主要的遺傳模式(http://hereditaryhearingloss.org/)，其中DFNB多表現(xiàn)為語前聾和全頻聽力下降，聽力損失程度較重，而DFNA多表現(xiàn)為遲發(fā)性和進(jìn)行性的 聽力損失。因DFNA發(fā)病涉及生長發(fā)育多個階段，新生兒聽力篩查往往難以識別，其危 害性更難以防控。明確DFNA致病基因?qū)⒂欣谠缭\斷、早干預(yù)并提升康復(fù)效果，同時 對已知DFNA致病基因進(jìn)行功能研究還將為遺傳性耳聾的治療提供靶點和干預(yù)策略。

發(fā)明人在國際上首次定位和克隆了一個新的DFNA相關(guān)致病基因OSBPL2(OMIM:606731,DFNA67)。隨后，該基因又分別在德國和蒙古DFNA家系中獲得了確證。這三 個家系的耳聾患者均攜有OSBPL2移碼突變，表現(xiàn)為遲發(fā)性、中度至深度聽力損失，并 在家系成員中呈現(xiàn)典型的遺傳共分離。OSBPL2編碼蛋白與氧化固醇結(jié)合蛋白(Oxysterol BindingProtein,OSBP)高度同源，屬于ORP蛋白家族(OSBP-Related Protein,ORP)成員。 OSBPL2蛋白羧基端含有OSBP/ORPs家族共有的OSBP相關(guān)配體結(jié)合域(OSBP-related Ligand-bindingDomain,ORD)以及高度保守的OSBP指紋列“EQVSHHPP”，OSBPL2對 于細(xì)胞內(nèi)固醇代謝、轉(zhuǎn)運及其穩(wěn)態(tài)維持具有重要作用，并影響細(xì)胞的功能。基于OSBPL2 同源基因在模型動物中的時空表達(dá)與定位提示，OSBPL2在耳蝸中的表達(dá)對正常的聽覺 功能是必要的，但OSBPL2突變致聾的分子發(fā)病機(jī)制尚未闡明。

隨著鋅指核酸酶(Zinc-finger Nucleases,ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(Transcription Activator-like Effector Nucleases,TALEN)和CRISPR/Cas9等高效基因編輯 技術(shù)的發(fā)展與完善，構(gòu)建基因敲除的動物模型為從病因和分子病理學(xué)基礎(chǔ)上研究遺傳性 耳聾的發(fā)病機(jī)制提供了更有效途徑。雖然小鼠等嚙齒類動物的聽器結(jié)構(gòu)與功能以及突變 體的表型與人有一定相似性，但在發(fā)育遺傳上與人有較大差異，并不能完全復(fù)制人的耳 聾表型。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：本發(fā)明第一方面提供了一種耳聾模型豬的重構(gòu)卵及其構(gòu)建方法；第二方 面提供了一種耳聾模型豬、構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

技術(shù)方案：本發(fā)明第一方面所述一種耳聾模型豬的重構(gòu)卵的構(gòu)建方法，包括以下步 驟：