[發(fā)明專利]一種耳聾模型豬的重構(gòu)卵及其構(gòu)建方法，耳聾模型豬、構(gòu)建方法及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910603387.2
• 申請日: 2019-07-05
• 公開（公告）號: CN110468154A
• 公開（公告）日: 2019-11-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曹新;姚俊;曾華沙;楊海元;王盈;邢光前;陳智斌;魏欽俊;魯雅潔;戴一凡
• 申請（專利權(quán)）人: 南京醫(yī)科大學(xué);江蘇省人民醫(yī)院(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C12N9/22;C12N15/877;C12N5/10;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 32237 江蘇圣典律師事務(wù)所
• 代理人: 胡建華<國際申請>=<國際公布>=<進(jìn)入

1.一種耳聾模型豬的重構(gòu)卵的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)針對豬物種的OSBPL2基因的OSBP指紋基序編碼序列及其上游編碼序列設(shè)計(jì)gRNA識別序列，所述OSBPL2基因的OSBP指紋基序編碼的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，所述OSBP指紋基序編碼序列核苷酸序列如SEQ ID No:2所示，所述OSBP指紋基序編碼序列及其上游編碼序列如SEQ ID No:3所示；

(2)對所述gRNA識別序列設(shè)計(jì)互補(bǔ)序列，以構(gòu)建含有該gRNA識別序列的雙鏈DNA；

(3)構(gòu)建含Cas9骨架以及步驟(2)中所述雙鏈DNA的gRNA表達(dá)載體；

(4)將步驟(3)中所述gRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞，篩選出OSBPL2基因敲除的陽性克隆細(xì)胞；

(5)將步驟(4)篩選得到的陽性克隆細(xì)胞注入母豬的去核卵母細(xì)胞，形成重構(gòu)卵。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(1)中所述gRNA識別序列或其互補(bǔ)序列與所述OSBPL2基因的OSBP指紋基序編碼序列及其上游編碼序列部分一致或?yàn)橄鄳?yīng)的同義突變。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述gRNA識別序列如SEQ ID No:4、SEQ ID No:5或SEQ ID No:6所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，當(dāng)所述gRNA識別序列如SEQ ID No:4所示，所述正向寡核苷酸序列如SEQ ID No:7所示，所述反向寡核苷酸序列如SEQ ID No:10所示；當(dāng)所述gRNA識別序列如SEQ ID No:5所示，所述正向寡核苷酸序列如SEQ ID No:8所示，所述反向寡核苷酸序列如SEQ ID No:11所示；當(dāng)所述gRNA識別序列如SEQ ID No:6所示，所述正向寡核苷酸序列如SEQ ID No:9所示，所述反向寡核苷酸序列如SEQ ID No:12所示。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(3)中所述gRNA表達(dá)載體的構(gòu)建包括如下步驟：將所述雙鏈DNA連接至pX330載體得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α中并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，確定gRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功。

6.權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的耳聾模型豬的重構(gòu)卵。

7.一種耳聾模型豬的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)按照權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到耳聾模型豬的重構(gòu)卵；

(2)對步驟(1)獲得的重構(gòu)卵進(jìn)行細(xì)胞融合和激活，得到激活的重構(gòu)卵；

(3)將步驟(2)激活的重構(gòu)卵在體外培養(yǎng)至囊胚階段；

(4)將步驟(3)得到的囊胚移植到代孕母豬的子宮內(nèi)；

(5)將步驟(4)獲得的代孕母豬圈養(yǎng)，生產(chǎn)獲得耳聾模型豬。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(2)中所述細(xì)胞融合和激活的步驟如下：取重構(gòu)卵置于平衡液處理；將平衡好的重構(gòu)卵移至融合槽內(nèi)，輕撥重構(gòu)卵與注入的細(xì)胞的接觸面平行于兩條電極，兩條電極間的間隔為1mm，然后進(jìn)行電脈沖刺激，電融合參數(shù)為：120Volts/mm，30μs，再重復(fù)1次；電脈沖刺激后將重構(gòu)卵移入胚胎操作液中，篩選成功融合的重構(gòu)卵。

9.權(quán)利要求7-8任意一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的耳聾模型豬。

10.權(quán)利要求9所述耳聾模型豬在針對耳聾疾病進(jìn)行藥物實(shí)驗(yàn)和臨床前藥物篩選中的應(yīng)用。