[發(fā)明專利]一種超聲輔助酶法降解幾丁質(zhì)生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的方法

在審

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• 申請日: 2019-07-05
• 公開（公告）號: CN110511971A
• 公開（公告）日: 2019-11-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳可泉;王瑩瑩;楊賽;張阿磊;莫曉芳;周寧;許晟;曹飛;歐陽平凱
• 申請（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12P19/26
• 分類號: C12P19/26
• 代理公司: 32285 南京先科專利代理事務(wù)所(普通合伙)
• 代理人: 葉帥東<國際申請>=<國際公布>=<進(jìn)入

本發(fā)明公開了一種超聲輔助酶法降解幾丁質(zhì)生產(chǎn)N?乙酰氨基葡萄糖的方法，該方法包括如下步驟：（1）利用微生物發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶，獲得濃縮酶液；（2）稱取幾丁質(zhì)粉末，依次加入純水和磷酸緩沖液，再加入幾丁質(zhì)酶進(jìn)行超聲輔助酶解反應(yīng)；（3）待反應(yīng)結(jié)束后，向超聲輔助酶解組中加入DNS，煮沸5min，測定還原糖含量。該方法的優(yōu)點在于利用超聲手段快速簡單地獲得大量的N?乙酰氨基葡萄糖，相比未處理的酶解幾丁質(zhì)法，前者的效率更高，獲得的最高轉(zhuǎn)化效率是未處理的2.9倍。且該方法所用時間較短，耗材少，操作簡單，酶解效率高，無化學(xué)污染，環(huán)境友好，具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于N- 乙酰氨基葡萄糖的制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種超聲輔助酶法降解幾丁質(zhì)生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的方法。

背景技術(shù)

幾丁質(zhì)（Chitin），也被稱為甲殼素、甲殼質(zhì)或殼多糖，主要存在于蝦蟹貝類及昆蟲等甲殼中，其中蝦蟹殼中的含量最為豐富。該大分子是一種由單體N-乙酰氨基葡萄糖以β-1，4糖苷鍵連接而成的多糖。通過化學(xué)酸堿法和生物酶法都可將其降解為幾丁寡糖和單糖。但酸堿法對環(huán)境污染極大，且反應(yīng)過程不易控制，反應(yīng)效率低，得到的產(chǎn)品質(zhì)量差，而生物酶法以其反應(yīng)溫和，便于控制，且環(huán)境友好等優(yōu)點得以推廣。

N-乙酰氨基葡萄糖作為幾丁質(zhì)的單體分子，近年來在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、化妝品行業(yè)及環(huán)境保護(hù)方面顯示出廣闊的前景。但由于幾丁質(zhì)的結(jié)晶度高，不溶于水的特性，使得生物酶法降解幾丁質(zhì)生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的轉(zhuǎn)化效率低，難以滿足工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)。現(xiàn)已報道的高壓均質(zhì)法，研磨法，瞬間蒸汽爆破法等各方法由于高壓，研磨效率低下，耗費時間過長，及高溫危險性等存在不足。因此，找到一種簡單有效的幾丁質(zhì)預(yù)處理方法，降低其結(jié)晶度，使其與幾丁質(zhì)酶結(jié)合更緊密，快速催化幾丁質(zhì)的水解，從而提高N-乙酰氨基葡萄糖的轉(zhuǎn)化效率顯得極為重要。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種超聲輔助酶法降解幾丁質(zhì)生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的方法。超聲輔助酶法降解幾丁質(zhì)的條件進(jìn)行了優(yōu)化，通過與未處理的普通酶解幾丁質(zhì)對比，極大程度提高了幾丁質(zhì)的降解效率，可獲得大量的N-乙酰氨基葡萄糖。

一種超聲輔助酶法降解幾丁質(zhì)生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的方法，包括以下步驟：

步驟1，微生物發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶，并獲得濃縮酶液

將Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1（ATCC BAA-2140^T） 菌株接種到種子液培養(yǎng)基中，37℃、200rpm 下培養(yǎng) 12 h，再以體積分?jǐn)?shù) 5% 的接種量接入裝有產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基搖瓶中，在溫度為 26℃，轉(zhuǎn)速為 200rpm，初始 pH7.5 下發(fā)酵 72 h 后收集發(fā)酵液；將獲得的發(fā)酵液在4℃離心機中8000g離心，分離菌體，收集上清液，得到幾丁質(zhì)粗酶液；將粗酶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上抽真空濃縮，濃縮2-3h，得到原來0.3-0.6倍體積的濃縮酶液；

步驟2，超聲輔助幾丁質(zhì)酶降解幾丁質(zhì)

稱取0.005 g-0.03 g幾丁質(zhì)，依次加入1-5 mL純水和緩沖液，然后向里面加入濃縮酶液，震蕩均勻后在60%-100%功率的超聲波清洗機中在37℃下超聲0.5-3h；

步驟3，向反應(yīng)體系中加入1-5 mL的DNS，沸水煮5min，冷卻至室溫，觀察體系顏色變化情況，并離心后取上清液，在波長540nm下測吸光值即得還原糖的含量。

作為優(yōu)選的是，所述的幾丁質(zhì)酶液產(chǎn)于菌株Chitinolyticbacter meiyuanensisSYBC-H1 的保藏編號為CGMCC 3438 ^T，ATCC BAA-2140^T。