[發明專利]一種腫瘤細胞表面標志分子PD-L1的檢測方法

在審

• 申請號: 201910601477.8
• 申請日: 2019-07-04
• 公開（公告）號: CN110361536A
• 公開（公告）日: 2019-10-22
• 發明（設計）人: 顏菁;相鴻坤
• 申請（專利權）人: 昆山匯先醫藥技術有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/574
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司 32103
• 代理人: 李萍

本發明公開了一種腫瘤細胞表面標志分子PD?L1的檢測方法，其提高了檢測的準確性。一種腫瘤細胞表面標志分子PD?L1的檢測方法，包括如下步驟：A、提供捕獲篩，所述捕獲篩包括網狀基體及孵育形成在所述網狀基體上的EpCAM抗體；B、使分離自體液的有核細胞流過所述捕獲篩，以使有核細胞中的腫瘤細胞結合至所述捕獲篩上；C、用甲醛將捕獲的腫瘤細胞固定在所述捕獲篩上；D、依次采用PD?L1一抗溶液、標記有熒光基團AlexaFluor 647的PD?L1二抗溶液、pan?CK?AlexaFluor488一抗溶液、CD45一抗溶液及標記有熒光基團AlexaFluor 568的CD45二抗溶液對所述捕獲篩上固定的細胞進行孵育，然后用細胞核熒光染料標記出所述捕獲篩上的所有細胞。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種腫瘤細胞表面標志分子PD-L1的檢測方法。

背景技術

程序性死亡受體-1(PD-1)是主要的免疫檢查點受體，通過結合其配體程序性死亡配體-1(PD-L1)，使T細胞效應功能的下調，從而有助于維持對腫瘤細胞的耐受性。目前市場上針對PD-1和PD-L1的抑制劑主要有三種，pembrolizumab(商品名：Keytruda)、Nibolumab(商品名：Opdivo)和Atezolizumab(商品名：Tecentriq)，可用于黑色素瘤、非小細胞肺癌、膀胱癌等多種癌癥的治療。但是，并不是所有患者都能從PD-1/PD-L1抑制劑治療過程中受益，PD-1/PD-L1抑制劑目前只在少部分的癌癥病人身上可以產生持久控制腫瘤的效果。因此，檢測病人是否有PD-L1陽性表達，能夠有效幫助病人選擇合適的藥物用于治療。目前，PD-1/PD-L1的檢測方法主要是基于細胞蛋白水平的檢測，在臨床中，主要采用免疫組化的方法，利用手術或穿刺后取得的腫瘤組織進行切片染色。免疫組化的結果與病理醫師的經驗密切相關。因此，我們迫切需要一種新的無創的、評價方法和標準較為穩定的PD-L1檢測方法。

其中，循環腫瘤細胞是由原發灶脫落，進入血循環后，在遠處器官或原發臟器定居，形成轉移灶。循環腫瘤細胞CTC檢測作為液體活檢的熱門領域，在腫瘤診斷、治療和監控等方面的臨床表現已逐漸嶄露頭角，是目前最具發展潛力的腫瘤無創診斷和實時療效監測手段，臨床應用價值極其顯著。因此，若能提供一種檢測循環腫瘤細胞等腫瘤細胞表面PD-L1的方法，將具有非常重要的意義。

中國專利CN201810312287.X即公開了一種循環腫瘤細胞表面標志分子PD-L1的檢測方法。其包括以下步驟：(1)將全血用紅細胞裂解液處理，分離出有核細胞，并用甲醛進行固定；(2)先通過腫瘤免疫熒光標志物細胞角蛋白抗體anti-CK進行陽性篩選，用PDL1-抗孵育所有細胞，然后用標記有FITC熒光基團的PD-L1二抗孵育，再用細胞核熒光染料DAPI 標記出所有細胞；(3)采用高通量多色成像分析，選擇CY5、FITC和DAPI的濾光片，觀察通道表面熒光顏色，最終實現對循環腫瘤細胞表面標志分子PD-L1的檢測。這種檢測方法采用全血用紅細胞裂解液處理，分離出有核細胞，未能直接分離出CTC細胞，背景細胞復雜，難以保證檢測的準確性。

發明內容

本發明的目的是提供一種腫瘤細胞表面標志分子PD-L1的檢測方法，其提高了檢測的準確性。

為達到上述目的，本發明采用的技術方案為：

一種腫瘤細胞表面標志分子PD-L1的檢測方法，包括如下步驟：

A、提供捕獲篩，所述捕獲篩包括網狀基體及孵育形成在所述網狀基體上的EpCAM抗體；

B、使分離自體液的有核細胞流過所述捕獲篩，以使有核細胞中的腫瘤細胞結合至所述捕獲篩上；

C、用甲醛將捕獲的腫瘤細胞固定在所述捕獲篩上；