[發明專利]一種腫瘤細胞表面標志分子PD-L1的檢測方法

在審

• 申請號: 201910601477.8
• 申請日: 2019-07-04
• 公開（公告）號: CN110361536A
• 公開（公告）日: 2019-10-22
• 發明（設計）人: 顏菁;相鴻坤
• 申請（專利權）人: 昆山匯先醫藥技術有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/574
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司 32103
• 代理人: 李萍

1.一種腫瘤細胞表面標志分子PD-L1的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

A、提供捕獲篩，所述捕獲篩包括網狀基體及孵育形成在所述網狀基體上的EpCAM抗體；

B、使分離自體液的有核細胞流過所述捕獲篩，以使有核細胞中的腫瘤細胞結合至所述捕獲篩上；

C、用甲醛將捕獲的腫瘤細胞固定在所述捕獲篩上；

D、依次采用PD-L1一抗溶液、標記有熒光基團AlexaFluor 647的PD-L1二抗溶液、pan-CK-AlexaFluor 488一抗溶液、CD45一抗溶液及標記有熒光基團AlexaFluor 568的二抗溶液對所述捕獲篩上固定的細胞進行孵育，然后用細胞核熒光染料標記出所述捕獲篩上的所有細胞。

2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟A中，所述網狀基體包括不銹鋼體以及覆蓋于所述不銹鋼體表面的保護層，所述保護層由貴金屬或其合金制成，所述EpCAM抗體覆設于所述保護層上。

3.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述EpCAM抗體通過traut’s試劑或帶有生物素-親和素的硫醇鹽分子連接于所述保護層上。

4.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述網狀基體的尺寸為2-10 mm×2-10 mm，所述篩的孔為20 μm-100 μm。

5.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟B中，在有核細胞流過所述捕獲篩且腫瘤細胞結合至所述捕獲篩上后，使用細胞清洗液沖洗所述捕獲篩以去除沒有結合至所述捕獲篩的雜物或細胞。

6.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟B中，所述有核細胞分離自血液、尿液或腹腔液。

7.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟C中，將結合有腫瘤細胞的捕獲篩放入4%多聚甲醛溶液中，室溫固定10~60min，使用磷酸鹽緩沖液清洗。

8.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟D中的孵育具體實施如下：

加入PD-L1一抗溶液，室溫孵育所述捕獲篩上固定的細胞20~80 min，然后使用磷酸鹽緩沖液清洗；

加入標記有熒光基團AlexaFluor 647的PD-L1二抗溶液，室溫孵育20~80min，使用磷酸鹽緩沖液清洗；

加入pan-CK-AlexaFluor 488一抗溶液，室溫孵育所述捕獲篩上固定的細胞20~80min，使用磷酸鹽緩沖液清洗；

加入CD45一抗溶液，室溫孵育所述捕獲篩上固定的細胞20~80 min，使用磷酸鹽緩沖液清洗；

加入標記有熒光基團AlexaFluor 568的二抗溶液，室溫孵育20~80min，使用磷酸鹽緩沖液清洗。

9.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟D中，用細胞核熒光染料DAPI標記出所述捕獲篩上的所有有核細胞。

10.根據權利要求1-9任一項所述的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法還包括如下步驟：

E、采用CY5、FITC、PE和DAPI的濾光片通過高通量多色成像分析，觀察通道表面熒光顏色，對腫瘤細胞表面標志分子PD-L1進行檢測。