[發(fā)明專利]一種尋找胚胎干細(xì)胞向原始生殖細(xì)胞分化過程中Wnt信號(hào)通路的靶基因的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910593462.1
• 申請(qǐng)日: 2019-07-03
• 公開（公告）號(hào): CN110272919A
• 公開（公告）日: 2019-09-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李碧春;張晨;左其生;王曼;金晶;李婷婷;張亞妮;孫紅艷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 揚(yáng)州大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/867
• 分類號(hào): C12N15/867;C12N15/66;C12N5/10;C12Q1/686
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 馬云華

本發(fā)明提供一種尋找胚胎干細(xì)胞向原始生殖細(xì)胞分化過程中Wnt信號(hào)通路的靶基因的方法，涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明所述方法首先對(duì)Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子TCF7L2進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，對(duì)預(yù)測(cè)靶基因進(jìn)行GO功能注釋，篩選出其中共同參與生殖細(xì)胞發(fā)育及干細(xì)胞分化的保守性靶基因作為待選靶基因；通過體內(nèi)外試驗(yàn)驗(yàn)證Wnt信號(hào)對(duì)待選靶基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控作用，檢測(cè)待選靶基因的啟動(dòng)子中所述轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)缺失時(shí)、Wnt信號(hào)對(duì)待選靶基因轉(zhuǎn)錄水平是否有調(diào)節(jié)作用，通過ChIP?qPCR驗(yàn)證β?Catenin/轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物與待選靶基因的結(jié)合作用，從而確定待選靶基因是否對(duì)Wnt信號(hào)具有靶向響應(yīng)作用。本發(fā)明所述方法簡單易行。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種尋找胚胎干細(xì)胞向原始生殖細(xì)胞分化過程中Wnt信號(hào)通路的靶基因的方法。

背景技術(shù)

ESCs(胚胎干細(xì)胞)向PGCs(原始生殖細(xì)胞)特化是生殖細(xì)胞發(fā)生的第一個(gè)關(guān)鍵步驟，盡管不同物種間PGCs特化的機(jī)制有所不同，但均結(jié)合了體細(xì)胞發(fā)育程序的抑制、多能性細(xì)胞程序的啟動(dòng)以及全基因組表觀遺傳重編程三個(gè)方面復(fù)雜的動(dòng)態(tài)變化。目前，對(duì)于前兩者的研究較為透徹，且越來越多的證據(jù)表明體細(xì)胞的抑制和多能細(xì)胞的啟動(dòng)均經(jīng)歷一些相同基因表達(dá)的分子調(diào)控，包括細(xì)胞因子、RNA結(jié)合蛋白以及關(guān)鍵基因的調(diào)節(jié)，這些基因在PGCs發(fā)生的不同階段發(fā)揮功能，廣泛涉及PGCs的特化、遷移、增殖和存活，其特異性敲除個(gè)體將導(dǎo)致PGCs不同表態(tài)的喪失。Wnt信號(hào)作為明星信號(hào)通路之一，參與多種生物學(xué)過程，包括雞PGCs的形成過程，但是其在PGCs形成過程中通過何種靶基因發(fā)揮作用還尚未明確。

目前，已有大量研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路是生殖細(xì)胞形成的關(guān)鍵的信號(hào)。其作用機(jī)制主要通過β-Catenin/TCF核心效應(yīng)因子以及表觀遺傳機(jī)制介導(dǎo)的靶基因的激活。然而到目前為止，除了廣為人知的c-MYC、cyclin D1等Wnt靶基因外，還有一些關(guān)鍵性的Wnt信號(hào)通路的靶基因未找到，例如目前仍未找到參與家禽PGCs生成的關(guān)鍵靶基因。因此，急需一種有效篩選Wnt信號(hào)通路的靶基因的方法

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為了克服目前缺少一種篩選Wnt信號(hào)通路的靶基因的缺陷，提供了一種尋找胚胎干細(xì)胞向原始生殖細(xì)胞分化過程中Wnt信號(hào)通路的靶基因的方法，本方法簡單易行，操作可行性較高，為研究Wnt信號(hào)如何通過靶基因調(diào)控PGCs形成提供基礎(chǔ)。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種尋找胚胎干細(xì)胞向原始生殖細(xì)胞分化過程中Wnt信號(hào)通路的靶基因的方法，包括以下步驟：

(1)采用預(yù)測(cè)軟件對(duì)Wnt信號(hào)通路的某一轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合靶基因預(yù)測(cè)，對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行GO功能注釋，根據(jù)注釋選取生殖細(xì)胞發(fā)育和干細(xì)胞發(fā)育過程中共同的靶基因，得到待選靶基因；

(2)對(duì)待選靶基因進(jìn)行體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Wnt信號(hào)通路對(duì)待選靶基因轉(zhuǎn)錄水平是否有調(diào)節(jié)作用；

(3)檢測(cè)待選靶基因的啟動(dòng)子中所述轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)缺失時(shí)、Wnt信號(hào)對(duì)待選靶基因轉(zhuǎn)錄水平是否有調(diào)節(jié)作用；

(4)通過ChIP-qPCR驗(yàn)證β-Catenin/轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物與待選靶基因的結(jié)合作用；

(5)若待選靶基因經(jīng)過步驟(2)～(4)的檢測(cè)的結(jié)果為：Wnt信號(hào)通路對(duì)待選靶基因轉(zhuǎn)錄水平有調(diào)節(jié)作用、待選靶基因的啟動(dòng)子中所述轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)缺失時(shí)的Wnt信號(hào)通路對(duì)待選靶基因轉(zhuǎn)錄水平無調(diào)節(jié)作用并且β-Catenin/轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物能夠通過結(jié)合待選靶基因啟動(dòng)子區(qū)域調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄，則判斷該待選靶基因?yàn)閃nt信號(hào)通路的直接靶基因；

所述步驟(2)～(4)之間無時(shí)間順序上的限定。

優(yōu)選的，所述步驟(1)利用在線軟件對(duì)不同物種的Wnt信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。

優(yōu)選的，步驟(2)所述體內(nèi)實(shí)驗(yàn)包括以下步驟：