[發明專利]一種尋找胚胎干細胞向原始生殖細胞分化過程中Wnt信號通路的靶基因的方法

在審

• 申請號: 201910593462.1
• 申請日: 2019-07-03
• 公開（公告）號: CN110272919A
• 公開（公告）日: 2019-09-24
• 發明（設計）人: 李碧春;張晨;左其生;王曼;金晶;李婷婷;張亞妮;孫紅艷
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/66;C12N5/10;C12Q1/686
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 馬云華

1.一種尋找胚胎干細胞向原始生殖細胞分化過程中Wnt信號通路的靶基因的方法，包括以下步驟：

(1)采用預測軟件對Wnt信號通路的某一轉錄因子的結合靶基因預測，對預測的靶基因進行GO功能注釋，根據注釋選取生殖細胞發育和干細胞發育過程中共同的靶基因，得到待選靶基因；

(2)對待選靶基因進行體內和體外實驗驗證Wnt信號通路對待選靶基因轉錄水平是否有調節作用；

(3)檢測待選靶基因的啟動子中所述轉錄因子結合位點缺失時、Wnt信號對待選靶基因轉錄水平是否有調節作用；

(4)通過ChIP-qPCR驗證β-Catenin/轉錄因子復合物與待選靶基因的結合作用；

(5)若待選靶基因經過步驟(2)～(4)的檢測的結果為：Wnt信號通路對待選靶基因轉錄水平有調節作用、待選靶基因的啟動子中所述轉錄因子結合位點缺失時的Wnt信號通路對待選靶基因轉錄水平無調節作用并且β-Catenin/轉錄因子復合物能夠通過結合待選靶基因啟動子區域調節其轉錄，則判斷該待選靶基因為Wnt信號通路的直接靶基因；

所述步驟(2)～(4)之間無時間順序上的限定。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)利用在線軟件對不同物種的Wnt信號通路的轉錄因子能夠結合的靶基因進行預測。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述體內實驗包括以下步驟：

A1、分別制備Wnt過表達載體、Wnt慢病毒干擾載體、β-Catenin過表達載體和β-Catenin慢病毒干擾載體；

A2、分別將Wnt過表達載體、Wnt慢病毒干擾載體、β-Catenin過表達載體和β-Catenin慢病毒干擾載體轉入孵化55～60h的雞胚中，繼續孵化4.5d后，以qRT-PCR檢測生殖器官中的待選靶基因的表達情況。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述體外試驗包括以下步驟：

B1、分別制備Wnt過表達載體、Wnt慢病毒干擾載體、β-Catenin過表達載體和β-Catenin慢病毒干擾載體；

B2、分別向胚胎干細胞轉染Wnt過表達載體、Wnt慢病毒干擾載體、β-Catenin過表達載體和β-Catenin慢病毒干擾載體，得到轉染后的胚胎干細胞；

B3、對轉染后的胚胎干細胞體外誘導，使其分化為原始生殖細胞，分別在誘導的第0d和第4d時檢測待測靶基因的表達情況。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述檢測待選靶基因的啟動子中所述轉錄因子結合位點缺失時、Wnt信號對待選靶基因轉錄水平是否有調節作用的方法包括以下步驟：

C1、以雙熒光素酶報告基因檢測系統篩選待選靶基因的啟動子的核心區域；

C2、根據所述核心區域制備轉錄因子結合位點突變的待選靶基因啟動子載體，所述轉錄因子結合位點突變的待選靶基因載體中含有雙熒光素酶報告基因；

C3、以待選靶基因啟動子核心區域的雙熒光素酶表達載體作為陽性對照，以pGL3-basic為陰性對照，將陽性對照、陰性對照以及步驟C2制備的突變位點不同的各轉錄因子結合位點突變的待選靶基因載體分別轉染DF1細胞，轉染48h后，檢測轉染后細胞的啟動活性。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟C1所述以雙熒光素酶報告基因檢測系統篩選待選靶基因的啟動子的核心區域的方法，包括以下步驟：

S1、根據預測待選靶基因5’UTR區域前2000bp的片段進行引物設計，設計缺失不同啟動子片段的上游引物，再設計一個下游引物，分別利用設計的各上游引物和下游引物對動物基因組進行PCR擴增，得到缺失不同片段的待選靶基因啟動子序列，再連接到含有熒光素酶報告載體上，得到缺失不同片段的待選靶基因啟動子載體；

S2、將缺失不同片段的待選靶基因啟動子載體與pRL-SV40共轉染DF1細胞，轉染48h后，檢測熒光素酶相對活性，計算缺失不同片段的待選靶基因啟動子的活性高低，確定待選靶基因的啟動子轉錄因子結合位點的核心區域。