[發(fā)明專(zhuān)利]一種MC1R基因單倍型的鑒定與應(yīng)用方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910592821.1
• 申請(qǐng)日: 2019-07-03
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110273010A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-09-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張龔煒;張文秀;鄧永琳;吳雨徽;左福元;劉安芳
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 西南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6888
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 重慶市信立達(dá)專(zhuān)利代理事務(wù)所(普通合伙) 50230
• 代理人: 陳炳萍

1.一種MC1R基因單倍型的鑒定方法，其特征在于，所述MC1R基因單倍型的鑒定方法包括：

步驟一，通過(guò)對(duì)MC1R基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，采用單端Sanger測(cè)序獲得變異序列；

步驟二，基于構(gòu)建的單倍型，對(duì)育種群毛色的基因型與表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，鑒定出控制黑羽的單倍型及黑羽純合基因型。

2.如權(quán)利要求1所述的MC1R基因單倍型的鑒定方法，其特征在于，所述步驟一通過(guò)對(duì)MC1R基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，采用單端Sanger測(cè)序獲得變異序列具體包括：

通過(guò)設(shè)計(jì)1組特異性識(shí)別雞MC1R基因的引物，將酚-氯仿抽提法純化的樣品總DNA作為PCR檢測(cè)的模板，制備20μL PCR反應(yīng)體系，并按照反應(yīng)程序?qū)嵤㏄CR；用1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，將符合要求的PCR產(chǎn)物進(jìn)行sanger測(cè)序；根據(jù)序列變異構(gòu)建的單倍型來(lái)判定雞毛色基因型。

3.如權(quán)利要求2所述的MC1R基因單倍型的鑒定方法，其特征在于，所述步驟一的通過(guò)對(duì)MC1R基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，采用單端Sanger測(cè)序獲得變異序列，雞毛色基因型的具體判定方法為：采集黑羽雞群與非黑羽雞群個(gè)體，對(duì)MC1R基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增并Sanger測(cè)序，比較分析黑羽與非黑羽雞群中SNPs位點(diǎn)，挑選出4個(gè)SNPs位點(diǎn)，利用PHASE軟件構(gòu)建出三種單倍型，其中單倍型H1對(duì)H2和H3表現(xiàn)為完全顯性，H1控制黑羽性狀；在黑羽個(gè)體中，H1H1為純合黑羽個(gè)體，而H1H2或H1H3為雜合黑羽個(gè)體。

4.如權(quán)利要求1所述的MC1R基因單倍型的鑒定方法，其特征在于，所述步驟二的基于構(gòu)建的單倍型，對(duì)育種群毛色的基因型與表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，鑒定出控制黑羽的單倍型及黑羽純合基因型具體包括：

通過(guò)測(cè)交獲得待測(cè)個(gè)體的表型與基因型；利用黑羽個(gè)體與非黑羽個(gè)體交配，根據(jù)后代出現(xiàn)黑羽與非黑羽的情況，判定待測(cè)個(gè)體的基因型；隨后對(duì)待測(cè)個(gè)體、非黑羽個(gè)體進(jìn)行MC1R基因的遺傳變異分析，基于單個(gè)變異位點(diǎn)基因型或多個(gè)變異位點(diǎn)單倍型與表型關(guān)聯(lián)分析，最后分析測(cè)交所確認(rèn)待測(cè)個(gè)體黑羽純合個(gè)體和雜合個(gè)體所對(duì)應(yīng)的基因型，確定黑羽純合基因型。

5.如權(quán)利要求1所述的MC1R基因單倍型的鑒定方法，其特征在于，所述通過(guò)對(duì)MC1R基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法為：

(1)、獲取雞血液或組織樣本，進(jìn)行DNA提取；

雞血5μL或組織30mg樣本的基因組DNA采用天根生化科技有限公司的血液/組織/細(xì)胞基因組提取試劑盒DP304提取或采用傳統(tǒng)的酚-氯仿法提取基因組DNA；

(2)、根據(jù)雞MC1R基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，PCR產(chǎn)物片段大小為1144bp；

PCR擴(kuò)增正向引物為5’-ATCCTTGTGCCTGGGGTG-3’，反向引物為5’-CATCCATCCATCCTCCTGTC-3’，其退火溫度60℃，延伸時(shí)間1min，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成并稀釋為10pmol/L的工作濃度；

PCR反應(yīng)體系為20μl：10μl 2xTaq PCR Master Mix，6.4μl ddH₂O，上下游引物各0.8μl，DNA模板2μl；

反應(yīng)程序：95℃變性3min，95℃變性45s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min；

電泳條件：2.5％EB電泳緩沖液中在180V的電壓條件下電泳20min；

(3)、將電泳檢測(cè)后符合目的片段大小的PCR產(chǎn)物送公司采用Sanger測(cè)序，測(cè)序引物序列為：5’-TGAGGATGAGGTGGAAGAAGAAGG-3’；Sanger測(cè)序方法參照測(cè)序公司要求進(jìn)行；

(4)將Sanger測(cè)序所獲得DNA序列利用SeqMan軟件結(jié)合人工進(jìn)行SNPs位點(diǎn)識(shí)別并判定每個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型；

(5)利用PHASE軟件對(duì)上述4個(gè)SNPs位點(diǎn)構(gòu)建單倍型。4個(gè)SNPs位點(diǎn)構(gòu)建成三種單倍型，其中單倍型H1對(duì)H2和H3表現(xiàn)為完全顯性，H1控制黑羽性狀；

(6)結(jié)合已知基因型的黑羽個(gè)體和非黑羽個(gè)體信息，判定在黑羽個(gè)體中，H1H1為純合黑羽個(gè)體，而H1H2或H1H3為雜合黑羽個(gè)體，實(shí)現(xiàn)對(duì)黑羽個(gè)體中純合個(gè)體和雜合個(gè)體的準(zhǔn)確區(qū)分。

6.一種利用權(quán)利要求1所述MC1R基因單倍型的鑒定方法在種質(zhì)資源進(jìn)行分型上的應(yīng)用。