[發明專利]一種MC1R基因單倍型的鑒定與應用方法

在審

• 申請號: 201910592821.1
• 申請日: 2019-07-03
• 公開（公告）號: CN110273010A
• 公開（公告）日: 2019-09-24
• 發明（設計）人: 張龔煒;張文秀;鄧永琳;吳雨徽;左福元;劉安芳
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 重慶市信立達專利代理事務所(普通合伙) 50230
• 代理人: 陳炳萍

1.一種MC1R基因單倍型的鑒定方法，其特征在于，所述MC1R基因單倍型的鑒定方法包括：

步驟一，通過對MC1R基因進行PCR擴增后，采用單端Sanger測序獲得變異序列；

步驟二，基于構建的單倍型，對育種群毛色的基因型與表型進行關聯分析，鑒定出控制黑羽的單倍型及黑羽純合基因型。

2.如權利要求1所述的MC1R基因單倍型的鑒定方法，其特征在于，所述步驟一通過對MC1R基因進行PCR擴增后，采用單端Sanger測序獲得變異序列具體包括：

通過設計1組特異性識別雞MC1R基因的引物，將酚-氯仿抽提法純化的樣品總DNA作為PCR檢測的模板，制備20μL PCR反應體系，并按照反應程序實施PCR；用1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，將符合要求的PCR產物進行sanger測序；根據序列變異構建的單倍型來判定雞毛色基因型。

3.如權利要求2所述的MC1R基因單倍型的鑒定方法，其特征在于，所述步驟一的通過對MC1R基因進行PCR擴增后，采用單端Sanger測序獲得變異序列，雞毛色基因型的具體判定方法為：采集黑羽雞群與非黑羽雞群個體，對MC1R基因進行PCR擴增并Sanger測序，比較分析黑羽與非黑羽雞群中SNPs位點，挑選出4個SNPs位點，利用PHASE軟件構建出三種單倍型，其中單倍型H1對H2和H3表現為完全顯性，H1控制黑羽性狀；在黑羽個體中，H1H1為純合黑羽個體，而H1H2或H1H3為雜合黑羽個體。

4.如權利要求1所述的MC1R基因單倍型的鑒定方法，其特征在于，所述步驟二的基于構建的單倍型，對育種群毛色的基因型與表型進行關聯分析，鑒定出控制黑羽的單倍型及黑羽純合基因型具體包括：

通過測交獲得待測個體的表型與基因型；利用黑羽個體與非黑羽個體交配，根據后代出現黑羽與非黑羽的情況，判定待測個體的基因型；隨后對待測個體、非黑羽個體進行MC1R基因的遺傳變異分析，基于單個變異位點基因型或多個變異位點單倍型與表型關聯分析，最后分析測交所確認待測個體黑羽純合個體和雜合個體所對應的基因型，確定黑羽純合基因型。

5.如權利要求1所述的MC1R基因單倍型的鑒定方法，其特征在于，所述通過對MC1R基因進行PCR擴增的方法為：

(1)、獲取雞血液或組織樣本，進行DNA提取；

雞血5μL或組織30mg樣本的基因組DNA采用天根生化科技有限公司的血液/組織/細胞基因組提取試劑盒DP304提取或采用傳統的酚-氯仿法提取基因組DNA；

(2)、根據雞MC1R基因設計引物進行PCR擴增，并進行瓊脂糖凝膠電泳，PCR產物片段大小為1144bp；

PCR擴增正向引物為5’-ATCCTTGTGCCTGGGGTG-3’，反向引物為5’-CATCCATCCATCCTCCTGTC-3’，其退火溫度60℃，延伸時間1min，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成并稀釋為10pmol/L的工作濃度；

PCR反應體系為20μl：10μl 2xTaq PCR Master Mix，6.4μl ddH₂O，上下游引物各0.8μl，DNA模板2μl；

反應程序：95℃變性3min，95℃變性45s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環，72℃延伸10min；

電泳條件：2.5％EB電泳緩沖液中在180V的電壓條件下電泳20min；

(3)、將電泳檢測后符合目的片段大小的PCR產物送公司采用Sanger測序，測序引物序列為：5’-TGAGGATGAGGTGGAAGAAGAAGG-3’；Sanger測序方法參照測序公司要求進行；

(4)將Sanger測序所獲得DNA序列利用SeqMan軟件結合人工進行SNPs位點識別并判定每個SNPs位點的基因型；

(5)利用PHASE軟件對上述4個SNPs位點構建單倍型。4個SNPs位點構建成三種單倍型，其中單倍型H1對H2和H3表現為完全顯性，H1控制黑羽性狀；

(6)結合已知基因型的黑羽個體和非黑羽個體信息，判定在黑羽個體中，H1H1為純合黑羽個體，而H1H2或H1H3為雜合黑羽個體，實現對黑羽個體中純合個體和雜合個體的準確區分。

6.一種利用權利要求1所述MC1R基因單倍型的鑒定方法在種質資源進行分型上的應用。