[發(fā)明專利]一種特異性檢測非洲豬瘟病毒的LAMP方法及其引物組合在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201910592331.1 | 申請日： | 2019-07-03 |
| 公開（公告）號： | CN110317904A | 公開（公告）日： | 2019-10-11 |
| 發(fā)明（設計）人： | 曹勝波;曹晨;黃少梅;葉靜;劉學芹 | 申請（專利權(quán)）人： | 華中農(nóng)業(yè)大學 |
| 主分類號： | C12Q1/70 | 分類號： | C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11 |
| 代理公司： | 武漢宇晨專利事務所 42001 | 代理人： | 張紅兵 |
| 地址： | 430070 湖*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 非洲豬瘟病毒 引物組合 種特異性 熒光定量PCR儀 篩選 基因組序列 特異性基因 特異性片段 特異性區(qū)域 特異性引物 靶DNA片段 動物病毒 檢測領(lǐng)域 結(jié)果判定 特異性強 熒光染料 在線軟件 模版DNA 靈敏度 靈敏性 檢測 擴增 靈敏 網(wǎng)頁 病毒 分析 | ||
本發(fā)明屬于動物病毒防制技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種特異性檢測非洲豬瘟病毒的LAMP方法及其引物組合，與靶DNA片段的檢測領(lǐng)域相關(guān)。篩選了一組高靈敏、特異性的LAMP引物，使用NCBI BLAST在線軟件分析針對非洲豬瘟病毒基因組序列的特異性基因B646L，利用LAMP primerexplorer網(wǎng)頁對該病毒特異性片段設計多組特異性引物，得到靈敏性最高，特異性最強的LAMP引物。利用LAMP快速擴增模版DNA特異性區(qū)域，通過加入熒光染料，可在熒光定量PCR儀上完成反應及結(jié)果判定，整個反應不超過50min。本發(fā)明篩選引物組合具有靈敏度高、特異性強特點。本發(fā)明LAMP方法操作簡單，成本低，結(jié)果易于判斷。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于動物傳染病仿制技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種特異性檢測非洲豬瘟病毒的LAMP方法及其引物組合。
背景技術(shù)
非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，簡稱ASFV)屬于非洲豬瘟病毒科，是該科的唯一成員，也是蟲媒傳播病毒中唯一一個DNA病毒。病毒中心是直徑為70—100nm的電子密度較高的DNA核心，核心外周是直徑172-191nm呈二十面體對稱的衣殼和含脂類的囊膜。基因組為雙股線狀DNA，大小為170-190kb。整個基因組有151個開放性閱讀框，編碼150-200種蛋白質(zhì)。非洲豬瘟病毒能引起非洲豬瘟，它是豬的一種急性、烈性傳染病，臨床上以高熱、全身性出血和高死亡率為特征。該病對養(yǎng)豬業(yè)危害巨大，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為一類疫病。
世界動物衛(wèi)生組織提供的陸地診斷手冊中關(guān)于非洲豬瘟檢測方法部分提到：非洲豬瘟不能通過臨床檢查或尸檢與經(jīng)典豬瘟區(qū)分開來，而且和豬的任何急性發(fā)熱性出血綜合征都容易混淆。因此，實驗室檢查對于區(qū)分這些疾病至關(guān)重要。目前實驗室檢查針對該病已經(jīng)建立了多種診斷方法。這些方法雖在實際診斷中發(fā)揮巨大作用，但也有其不足之處，例如有的操作繁雜，有的耗時費力。LAMP技術(shù)操作簡單，靈敏，快速,，檢測成本低,，且不需要特殊儀器設備,，具有較高的臨床實用性。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種特異性檢測非洲豬瘟病毒的LAMP方法及其引物組合。
本發(fā)明通過優(yōu)化了一組高度靈敏、特異性的LAMP引物，進一步優(yōu)化了非洲豬瘟病毒的LAMP檢測方法。利用NCBI BLAST在線軟件分析找到非洲豬瘟病毒特異性基因B646L的核苷酸序列，利用LAMP primerexplorer在線網(wǎng)頁(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)針對該病毒基因特異性片段設計多組特異性引物，通過試驗，最后優(yōu)化、篩選出靈敏性最高，特異性最強的引物。通過加入熒光染料，可在熒光定量PCR儀上完成反應及結(jié)果判定，整個反應不超過50min，且無需復雜的檢測儀器和檢測過程，對非洲豬瘟病毒現(xiàn)場實時檢測具有很好的應用價值。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下所述：
一種高靈敏、特異性地檢測非洲豬瘟病毒的LAMP方法，包括如下步驟：
(1)根據(jù)文獻報道選取非洲豬瘟病毒的特異性保守基因B646L(GenBank登錄號MH722357.1)，并確定基因序列的準確性；
(2)根據(jù)步驟(1)確定的序列，利用LAMP primer explorer在線網(wǎng)頁(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)設計如下多種特異性引物，這些引物分別針對特異性保守區(qū)的6個區(qū)域，每組引物包括一對F3/B3內(nèi)引物，一對FIP/BIP外引物和一對LF/LB環(huán)引物；對多組特異性引物進行篩選，最后確定出特異性最強、靈敏度最高的引物進行擴增；所述的LAMP引物的序列如下所述：
外引物：F3:ATCCAGAGCAAGAGAAT(與序列表SEQ ID NO:1所示的序列相同)；
B3:ATACCACAAGATCAGCCG(與序列表SEQ ID NO:2所示的序列相同)；
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