[發(fā)明專利]一種特異性檢測(cè)非洲豬瘟病毒的LAMP方法及其引物組合

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910592331.1
• 申請(qǐng)日: 2019-07-03
• 公開（公告）號(hào): CN110317904A
• 公開（公告）日: 2019-10-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曹勝波;曹晨;黃少梅;葉靜;劉學(xué)芹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 張紅兵

1.一種高靈敏、特異性地檢測(cè)非洲豬瘟病毒的LAMP方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)利用NCBI中BLAST軟件對(duì)GeneBank中ASFV的全基因組進(jìn)行分析，找出GenBank登錄號(hào)MH722357.1的特異性保守基因B646L，并確定基因序列的準(zhǔn)確性；

(2)根據(jù)步驟(1)確定的序列，針對(duì)特異性保守區(qū)基因B646L，利用LAMPprimerexplorer設(shè)計(jì)如下所述的特異性引物，這些引物分別針對(duì)特異性保守區(qū)的6個(gè)區(qū)域，每組引物包括一對(duì)F3/B3內(nèi)引物，一對(duì)FIP/BIP外引物和一對(duì)LF/LB環(huán)引物；對(duì)多組特異性引物進(jìn)行篩選，最后確定出特異性最強(qiáng)、靈敏度最高的引物進(jìn)行擴(kuò)增；

所述的LAMP引物的序列如下所述：

外引物：F3:ATCCAGAGCAAGAGAAT；

B3:ATACCACAAGATCAGCCG；

內(nèi)引物：FIP:CAAAGCAAAGGTAATCATCATCGCAATACCCTTCCACTACGGAG；

BIP:ACCAACCCAGTGGTCATATTAACTAGACCCCACGTAATCCG；

環(huán)引物：LF:GGGGGTTTTAATCGCATT；

LB:ATCCAGAGCAAGAGAAT；

(3)優(yōu)化后的LAMP體系為：20μmol/L的F3，B3引物各1μL；40μmol/L的FIP，BIP引物各1μL；10μmol/L的LF，LB引物各1μL；10×Bst buffer 2.5μL；10mmol/L的dNTP3.5μL；100mmol/L的Mg²⁺0.5μL；8U的Bst DNA聚合酶1.25μL；模板DNA 1μL；Eva Green20x 2μL，加滅菌雙蒸水至25ul LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系；

(4)構(gòu)建含目的片段的質(zhì)粒，濃度稀釋至10⁸拷貝/μL，取1μL加入反應(yīng)液中并混勻；

(5)置BIO-RAD96孔熒光定量PCR儀中進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，收集熒光信號(hào)，反應(yīng)程序?yàn)椋?3℃，20s，120個(gè)循環(huán)，SYBR通道收集熒光；

(6)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)熒光PCR儀的擴(kuò)增曲線和CT值判斷檢測(cè)結(jié)果；待測(cè)樣品發(fā)生擴(kuò)增，判斷檢測(cè)樣本為陽性；待測(cè)樣品不發(fā)生擴(kuò)增，判斷檢測(cè)樣本為陰性。

2.一種高靈敏、特異性地檢測(cè)非洲豬瘟病毒的LAMP引物組合，其特征在于，所述的LAMP引物組合如下所述：

外引物：F3:ATCCAGAGCAAGAGAAT；

B3:ATACCACAAGATCAGCCG；

內(nèi)引物：FIP:CAAAGCAAAGGTAATCATCATCGCAATACCCTTCCACTACGGAG；

BIP:ACCAACCCAGTGGTCATATTAACTAGACCCCACGTAATCCG；

環(huán)引物：LF:GGGGGTTTTAATCGCATT；

LB:ATCCAGAGCAAGAGAAT；

LAMP反應(yīng)體系：20μmol/L的F3，B3引物各1μL；40μmol/L的FIP，BIP引物各1μL；10μmol/L的LF，LB引物各1μL；10×Bst buffer 2.5μL；10mmol/L的dNTP3.5μL；100mmol/L的Mg²⁺0.5μL；8U的Bst DNA聚合酶1.25μL；模板DNA 1μL；Eva Green20x 2μL，加滅菌雙蒸水至25ulLAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系。

3.權(quán)利要求2所述的LAMP引物組合在制備檢測(cè)非洲豬瘟病毒試劑盒中的應(yīng)用。