[發(fā)明專利]Dnmt3b基因缺陷型的CHO細(xì)胞系及其制備方法、應(yīng)用，重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910590913.6
• 申請(qǐng)日: 2019-07-02
• 公開（公告）號(hào): CN110257340A
• 公開（公告）日: 2019-09-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賈巖龍;王天云;路江濤;郭瀟;倪天軍;肖夢珂;邱樂樂;林艷;趙春澎
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N15/90;C12N9/22;C12N15/85;C07K16/24
• 代理公司: 鄭州睿信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

本發(fā)明涉及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO細(xì)胞系及其制備方法、應(yīng)用，重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明中利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除CHO細(xì)胞Dnmt3b基因，得到了Dnmt3b基因缺陷型的CHO細(xì)胞系，該細(xì)胞系能夠顯著提高CHO細(xì)胞中目的基因的表達(dá)水平和表達(dá)穩(wěn)定性，克服了目前CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)存在的表達(dá)水平較低、表達(dá)不穩(wěn)定的問題；在利用該細(xì)胞系表達(dá)重組阿達(dá)木單抗時(shí)，發(fā)現(xiàn)重組阿達(dá)木單抗的表達(dá)水平明顯提高，因此該細(xì)胞系可以廣泛用于目的蛋白的表達(dá)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及Dnmt3b基因缺陷型的CHO細(xì)胞系及其制備方法、應(yīng)用，重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

由于具有能夠進(jìn)行重組蛋白的裝配和折疊以及翻譯后修飾等突出特點(diǎn)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞特別是中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary, CHO）細(xì)胞目前常被用于進(jìn)行重組藥物蛋白表達(dá)生產(chǎn)。但現(xiàn)階段在重組CHO細(xì)胞長期培養(yǎng)生產(chǎn)中存在表達(dá)量較低、表達(dá)不穩(wěn)定甚至表達(dá)量明顯下降等現(xiàn)象。為此，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，如何提高表達(dá)量和表達(dá)穩(wěn)定性已成為大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白亟待解決的主要問題。當(dāng)前由于缺乏既能實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)量又能穩(wěn)定表達(dá)的重組CHO細(xì)胞系，重組蛋白的生產(chǎn)規(guī)模仍然受到極大限制。因此，采用分子克隆和基因工程的方法進(jìn)行CHO細(xì)胞重組表達(dá)系統(tǒng)研究，對(duì)于提高重組蛋白的表達(dá)量和長期表達(dá)穩(wěn)定性，進(jìn)而建立高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重組CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)具有十分重要的理論和實(shí)踐意義。

造成這種重組蛋白產(chǎn)物表達(dá)不穩(wěn)定性的確切機(jī)制尚未確切闡明。轉(zhuǎn)基因表達(dá)減少的一個(gè)重要原因是持續(xù)表達(dá)過程中基因拷貝的逐漸丟失而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本減少和轉(zhuǎn)錄沉默的發(fā)生。通過應(yīng)用一些表觀遺傳調(diào)節(jié)的DNA順式作用元件如核基質(zhì)附著區(qū)序列（MAR）、普遍存在的染色質(zhì)開放元件（UCOE）可以顯著降低基因沉默以提高重組目的基因的表達(dá)。另外，轉(zhuǎn)基因沉默還與生產(chǎn)過程中重組蛋白表達(dá)載體上驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的啟動(dòng)子CpG位點(diǎn)的甲基化密切相關(guān)。如研究發(fā)現(xiàn)在單克隆抗體生產(chǎn)表達(dá)不穩(wěn)定的重組CHO細(xì)胞中，人巨細(xì)胞病毒主要即時(shí)早期（hCMV-MIE）啟動(dòng)子的甲基化水平是增加的；利用5-Aza-2-脫氧胞苷（一種DNA甲基化抑制劑）處理這些表達(dá)降低的細(xì)胞可以部分恢復(fù)其單克隆抗體的產(chǎn)率。這表明，表觀遺傳因素如DNA甲基化在調(diào)節(jié)基因表達(dá)中起重要作用，啟動(dòng)子區(qū)域DNA的甲基化異常增加可能是導(dǎo)致重組CHO細(xì)胞中目的基因表達(dá)下降的重要因素。

DNA甲基化（DNA methylation）是一種在原核和真核生物基因組中常見的表觀遺傳修飾方式，也是哺乳動(dòng)物中基因表達(dá)的重要調(diào)控方式，在基因轉(zhuǎn)錄抑制方面起關(guān)鍵作用。目前關(guān)于DNA甲基化對(duì)CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)基因表達(dá)影響的研究主要集中在啟動(dòng)子的修飾改造上，例如在啟動(dòng)子區(qū)域突變胞嘧啶、使用無CpG的或合成的啟動(dòng)子、或?qū)⒑诵腃pG島元件插入啟動(dòng)子。盡管這些經(jīng)過改造的無CpG二核苷酸的啟動(dòng)子可減少早期的基因沉默，但仍然不能顯著改善重組CHO細(xì)胞的長期表達(dá)穩(wěn)定性。DNA甲基化主要由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶包括從頭甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt3a和Dnmt3b以及DNA甲基化維持酶Dnmt1催化完成。特別是Dnmt3a和3b介導(dǎo)的啟動(dòng)子甲基化與轉(zhuǎn)基因的不穩(wěn)定表達(dá)密切相關(guān)，這提示二者在調(diào)控基因表達(dá)穩(wěn)定性方面起重要作用。

公開號(hào)為CN107828738A的中國發(fā)明專利申請(qǐng)中公開了一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶缺陷型CHO細(xì)胞系，該細(xì)胞系能夠明顯提高重組蛋白EPO的表達(dá)水平、同時(shí)克服重組蛋白表達(dá)不穩(wěn)定的問題，很大程度提高了重組蛋白表達(dá)穩(wěn)定性。但是在進(jìn)一步利用該系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)穩(wěn)定性驗(yàn)證時(shí)，發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)還存在目的蛋白表達(dá)穩(wěn)定性效果不理想、啟動(dòng)子DNA甲基化仍在一定程度發(fā)生的問題；按照生產(chǎn)中長期表達(dá)不加壓篩選的要求，在無G418篩選壓力時(shí)，傳代30次后重組蛋白的表達(dá)維持率尚未達(dá)到70%，表達(dá)量仍然偏低。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO細(xì)胞系，該細(xì)胞系中缺失的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt3b介導(dǎo)的表觀遺傳修飾與基因的表達(dá)調(diào)控關(guān)系更加密切，在沒有篩選壓力時(shí)，外源蛋白的表達(dá)更穩(wěn)定，表達(dá)量也明顯提高。