[發明專利]Dnmt3b基因缺陷型的CHO細胞系及其制備方法、應用，重組蛋白表達系統

在審

• 申請號: 201910590913.6
• 申請日: 2019-07-02
• 公開（公告）號: CN110257340A
• 公開（公告）日: 2019-09-20
• 發明（設計）人: 賈巖龍;王天云;路江濤;郭瀟;倪天軍;肖夢珂;邱樂樂;林艷;趙春澎
• 申請（專利權）人: 新鄉醫學院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/90;C12N9/22;C12N15/85;C07K16/24
• 代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

1.一種DNA甲基轉移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO細胞系，其特征在于：所述CHO細胞系中的Dnmt3b基因功能喪失，所述Dnmt3b基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根據權利要求1所述的DNA甲基轉移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO細胞系，其特征在于：CHO細胞系選自CHO-K1、CHO-S、CHO-DG44中的任意一種。

3.如權利要求1所述的DNA甲基轉移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO細胞系的制備方法，其特征在于：利用CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除CHO細胞中的Dnmt3b基因，即得。

4.根據權利要求3所述的DNA甲基轉移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO細胞系的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：

1）確定打靶位點：根據Dnmt3b基因序列設計兩個打靶位點sgRNA序列；

2）sgRNA載體的構建：將步驟1）設計的sgRNA序列添加粘性末端并合成2對4條引物，將配對的引物退火獲得對應的帶有粘性末端的雙鏈DNA片段，將雙鏈DNA片段分別連接到兩個帶有不同熒光報告基因CRISPR/Cas9系統表達載體中，獲得兩個CRISPR/Cas9-sgRNA載體；

3）將兩個CRISPR/Cas9-sgRNA載體共同轉染至CHO細胞中；流式分選挑選包含兩種熒光報告基因信號的單克隆細胞進行培養，經過細胞敲除驗證，即得。

5.根據權利要求4所述的DNA甲基轉移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO細胞系的制備方法，其特征在于：步驟1）中所述兩個打靶位點sgRNA序列分別為：

D3b-Ex1-31fw：5'-GAGGAATGTCTCATCGTCAATGG-3'；

D3b-Ex1-105fw：5'-CTTGGAGGCAATGTGCACAGAGG-3'。

6.根據權利要求5所述的DNA甲基轉移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO細胞系的制備方法，其特征在于：步驟2）中設計的4條引物分別為：

D3b-Ex1-31fw-1：5'-CACCGAGGAATGTCTCATCGTCAATGG-3'；

D3b-Ex1-31fw-2：5'-AAACCCATTGACGATGAGACATTCCTC-3'；

D3b-Ex1-105fw-3：5'--CACCGCTTGGAGGCAATGTGCACAGAGG-3'；

D3b-Ex1-105fw-4：5'-AAACCCTCTGTGCACATTGCCTCCAAGC-3'。

7.根據權利要求5所述的DNA甲基轉移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO細胞系的制備方法，其特征在于：步驟3）中細胞敲除驗證時，所使用的引物為：

Dnmt3b-Ex1PCR-L：5'-GTGCCCCCATTTCTCCTACT-3'；

Dnmt3b-Ex1PCR-R：5'-AGACCCAATGTGCTGGTCTC-3'。

8.如權利要求1所述的DNA甲基轉移酶Dnmt3b基因缺陷型的CHO細胞系在制備目的蛋白等方面的應用。

9.重組蛋白表達系統，其特征在于：其由包括如下步驟的方法制得：將目的基因插入表達載體中，構建得到重組蛋白表達載體；將該重組蛋白表達載體轉染至如權利要求1所述的Dnmt3b缺陷型的CHO細胞系，經篩選得到重組CHO細胞表達系統，所述重組CHO細胞表達系統能夠表達目的蛋白。

10.根據權利要求9所述的重組蛋白表達系統，其特征在于：所述目的蛋白為重組阿達木單抗。