[發明專利]一種產氣莢膜梭菌β毒素抗體捕獲ELISA檢測方法

有效

• 申請號: 201910588429.X
• 申請日: 2019-07-02
• 公開（公告）號: CN110261606B
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發明（設計）人: 王海榮;陳端;楚國茹;柴同杰;陳勇;鐘招兵
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20
• 代理公司: 濟南譽豐專利代理事務所(普通合伙企業) 37240
• 代理人: 薛鵬喜

本發明屬于動物免疫學技術領域，具體涉及一種產氣莢膜梭菌β毒素抗體捕獲ELISA檢測方法。本發明以抗產氣莢膜梭菌β毒素的單克隆抗體包被酶標板，以天然產氣莢膜梭菌β毒素作為捕獲抗原，建立產氣莢膜梭菌β毒素抗體捕獲ELISA檢測方法。本發明具有快速簡便、特異性強、靈敏度高等特點，適用于產氣莢膜梭菌β毒素抗體的檢測、流行病學調查及疫苗免疫效果評價等方面。

技術領域

本發明涉及動物免疫學技術領域，具體涉及一種產氣莢膜梭菌β毒素抗體捕獲ELISA檢測方法。

背景技術

產氣莢膜梭菌(C.perfringens)又稱魏氏梭菌(C.welchii)，廣泛存在于自然環境中，并見于幾乎所有溫血動物的消化道內，屬于人和動物腸道內正常菌群的成員。產氣莢膜梭菌能引起羔羊痢疾和羔羊、牛犢、仔豬、家兔、雛雞的壞死性腸炎、腸毒血癥等疾病，發病急、死亡率高，是嚴重危害養殖業的重要疾病，是近年來我國家畜“猝死癥”的主要病原，給各國畜牧業發展帶來巨大經濟損失。C型產氣莢膜梭菌主要產生β毒素(CPB)，本菌能引起人類氣性壞疽及多種動物的腸毒血癥和壞死性腸炎，當家畜被感染后其體內產生β毒素抗體，因此β毒素抗體是診斷C產氣莢膜梭菌病的重要依據之一。

目前，檢測產氣莢膜梭菌β毒素抗體的方法主要有中和試驗、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等，其中，中和試驗檢測產氣莢膜梭菌毒素抗體的經典方法，雖然簡單可靠，但費時費工；因此，中和試驗不適合大規模樣品的檢測和基層使用。而ELISA檢測具有操作簡單快速、成本低廉、可同時檢測大量樣品等優點，因此，發展產氣莢膜梭菌β毒素抗體的ELISA檢測方法，能夠為產氣莢膜梭菌病的診斷、流行病學調查、疫苗免疫效果評價等提供有效工具。

葉寶宏等建立了一種產氣莢膜梭菌β毒素抗體的間接ELISA檢測方法，其將原核表達重組質粒pET-28α-β轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，用IPTG進行誘導表達，表達產物經鎳柱親和層析純化、尿素梯度透析復性后進行Western?blot鑒定，用復性的β毒素重組蛋白作為包被抗原，通過優化間接ELISA試驗條件，建立產氣莢膜梭菌β毒素抗體的間接ELISA檢測方法。但是該方法是以原核表達的重組蛋白作為抗原，抗原決定簇的暴露和展現較差，對β毒素抗體的檢測敏感性有待進一步的提高。

發明內容

針對上述現有技術，本發明的目的是建立一種產氣莢膜梭菌β毒素抗體捕獲ELISA檢測方法，用于產氣莢膜梭菌β毒素抗體的檢測、流行病學調查及疫苗免疫效果評價等。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

本發明的第一方面，提供一種雜交瘤細胞株，保藏編號為CGMCC?NO.14894。

本發明所述雜交瘤細胞株由以下方法制備獲得：

利用純化后的天然產氣莢膜梭菌β毒素作為抗原免疫Balb/C小鼠，取免疫后小鼠的脾細胞與SP2/0細胞融合，再進行陽性克隆與亞克隆的篩選，最終篩選出一株能夠穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞2C8A，分類命名為產氣莢膜梭菌beta毒素雜交瘤細胞，并于2017年12月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC?NO.14894。

本發明的第二方面，提供一種單克隆抗體，由保藏編號為CGMCC?NO.14894的雜交瘤細胞株分泌產生。

所述單克隆抗體是由雜交瘤細胞株的培養液中獲得；或用雜交瘤細胞株接種到實驗動物腹腔產生腹水而獲得。

采用本發明雜交瘤細胞株制備的單克隆抗體，其特異性強、敏感性好、效價高。基于此，本發明的第三方面，提供上述雜交瘤細胞株或單克隆抗體在制備檢測產氣莢膜梭菌β毒素抗體的試劑盒中的應用。

本發明的第四方面，提供一種檢測產氣莢膜梭菌β毒素抗體的ELISA試劑盒；所述試劑盒包含有保藏編號為CGMCC?NO.14894的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體。