[發(fā)明專利]一種產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素抗體捕獲ELISA檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910588429.X
• 申請日: 2019-07-02
• 公開（公告）號: CN110261606B
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王海榮;陳端;楚國茹;柴同杰;陳勇;鐘招兵
• 申請（專利權(quán)）人: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20
• 代理公司: 濟(jì)南譽(yù)豐專利代理事務(wù)所(普通合伙企業(yè)) 37240
• 代理人: 薛鵬喜

1.一種單克隆抗體，其特征在于，由保藏編號為CGMCC?NO.14894的雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生。

2.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體在制備檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素抗體的試劑盒中的應(yīng)用。

3.一種檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素抗體的ELISA試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含有保藏編號為CGMCC?NO.14894的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體；

所述ELISA試劑盒中還包含有：抗原包被液、封閉液、捕獲抗原、二抗、陽性對照血清和陰性對照血清；

所述捕獲抗原由如下方法制備而成：

將C型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌種接種于血平板培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)蘇，厭氧培養(yǎng)，選取厭氧培養(yǎng)后的單個(gè)的菌落接種至液體硫乙醇培養(yǎng)基進(jìn)行増菌培養(yǎng)；然后將増菌液接種于改良的Gordon湯中，45℃培養(yǎng)4-6h產(chǎn)毒，將培養(yǎng)物離心后過濾除菌，得到除菌后的C型產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素；將外毒素進(jìn)行純化，即制備得到捕獲抗原；

所述的血平板培養(yǎng)基成分為：100ml去離子水、3.7g豆粉瓊脂、1g葡萄糖和5％體積比脫纖綿羊血；

所述改良的Gordon湯產(chǎn)毒培養(yǎng)基成分為：蛋白胨2g、糊精1g、酵母提取物2g、L-精氨酸1.2g、葡萄糖1g，最后PBS定容至100ml，濃鹽酸調(diào)節(jié)pH為7.5，高溫滅菌，即得。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的ELISA試劑盒，其特征在于，所述抗原包被液為：0.1M碳酸鹽緩沖液，pH?9.6。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的ELISA試劑盒，其特征在于，所述封閉液的組成為：5g脫脂奶粉溶于100mlPBST中。

6.一種非疾病診斷目的的產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素抗體捕獲ELISA檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)包被：將保藏編號為CGMCC?NO.14894的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體用抗原包被液稀釋到0.3μg/ml，每孔100μL，加入到96孔酶標(biāo)板，4℃密封過夜；

(2)封閉：將包被后的酶標(biāo)板用PBST洗滌液洗滌，洗滌后加入封閉液，每孔200μL，4℃封閉過夜；

(3)加抗原：將封閉后的酶標(biāo)板用PBST洗滌液洗滌，干燥，每孔加入用PBS緩沖液稀釋至2μg/ml的捕獲抗原100μL，37℃孵育1h；

(4)加待檢血清：將步驟(3)處理后的酶標(biāo)板用PBST洗滌液洗滌，干燥，每孔加入用PBS緩沖液以1:160體積比稀釋的待檢血清，每孔100μL，同時(shí)設(shè)置陰性對照、陽性對照和空白對照，其中，陰性對照加入陰性對照血清，陽性對照加入陽性對照血清，空白對照加入PBS緩沖液；37℃孵育1h；

(5)加二抗：將步驟(4)處理后的酶標(biāo)板用PBST洗滌液洗滌，干燥，加入用PBS緩沖液按1:8000體積比稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，37℃孵育1h；

(6)顯色：將步驟(5)處理后的酶標(biāo)板用PBST洗滌液洗滌，干燥，加入TMB底物顯色液100μL/孔，37℃條件下避光反應(yīng)15min；

(7)終止：每孔加入100μL?2M?H₂SO₄溶液終止反應(yīng)，450nm處讀取吸光值；

(8)結(jié)果判定：計(jì)算陰性樣品平均值與標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，求得為陽性臨界值，為陰性臨界值；測定待檢血清的OD_450nm，若待檢血清的為陽性，為陰性，為可疑樣品。