[發明專利]一種甘薯潛隱病毒蓮藕分離物RT-RPA檢測試劑盒與檢測方法

在審

• 申請號: 201910584680.9
• 申請日: 2019-07-01
• 公開（公告）號: CN110283942A
• 公開（公告）日: 2019-09-27
• 發明（設計）人: 賀振;董婷婷;吳偉文;陳雯;李良俊
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 薛海霞;董建林

本發明公開了一種甘薯潛隱病毒蓮藕分離物RT?RPA檢測試劑盒與檢測方法，其試劑盒包括2條特異性引物：SPLV?lotusRPA?F：GTCAACCATCCGCAACACCACCACAGTCAA；SPLV?lotusRPA?R：TCTTTGTGGGTATTGCAC GCAGCCGAGGTA，Prime Script?Reverse Transcriptase反轉錄酶、Oligo(dT)₁₅Primer、Ribonuclease Inhibitor抑制酶、dNTP、DNA Marker、pMD18?T載體、RNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、TwistAmp?DNA amplification kits和Mg²⁺。本發明以在非實驗室的條件下完成核酸擴增，在分子水平上為甘薯潛隱病毒蓮藕分離物的檢測提供了一種快速、靈敏、高通量的方法，適用于大量蓮藕樣品的檢測。

技術領域

本發明涉及植物病毒檢測技術領域，具體涉及一種甘薯潛隱病毒蓮藕分離物RT-RPA的檢測試劑盒與檢測方法。

背景技術

蓮藕(Nelumbo nucifera)是睡蓮科蓮屬多年生大型水生草本植物，原產中國和印度，有三千多年的栽培歷史，生產上可分為藕蓮、籽蓮和花蓮。蓮藕富含淀粉、蛋白質、維生素、礦物質等多種營養成分，是我國南方地區的主要水生蔬菜，其栽培面積近40余萬hm²。

甘薯潛隱病毒(Sweet potato latent virus，SPLV)屬于馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)，是1979年在中國臺灣的甘薯上首次發現的，其介體昆蟲為蚜蟲，可隨薯苗營養繁殖體及薯塊傳播。甘薯潛隱病毒具有變種和多樣性(比如甘薯潛隱病毒蓮藕分離物(Sweet potato latent virus-lotus，SPLV-lotus)，是本實驗室前期在蓮藕中發現的一種甘薯潛隱病毒新型分離物)。江蘇省蓮藕主產區SPLV-lotus感染越來越普遍，部分地區呈現流行爆發趨勢，因此脫毒蓮藕種苗的應用迫在眉睫。

發明內容

本發明目的在于提供一種甘薯潛隱病毒蓮藕分離物SPLV-lotus重組酶聚合酶擴增的檢測試劑盒與檢測方法。

甘薯潛隱病毒蓮藕分離物(Sweet potato latent virus-lotus，SPLV-lotus)，是本實驗室前期在蓮藕中發現的一種甘薯潛隱病毒新型分離物。該分離物與SPLV甘薯分離物具有很大的遺傳差異，核苷酸相似性在76.28％-76.60％之間，與最新的國際病毒分類委員會(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)制定的馬鈴薯Y病毒科病毒的分種標準相同，且該分離物與SPLV甘薯分離物有四個蛋白酶水解切隔識別位點存在差異，其編碼的PIPO的長度差異較大。SPLV-lotus自然條件下能夠侵染蓮藕，并且能有效侵染豆科、藜科、葫蘆科、茄科植物，但未見明顯的癥狀表現。2016年，我們在江蘇省蓮藕產區首次發現SPLV-lotus，后續調查發現，SPLV-lotus在江蘇省蓮藕主產區發生越來越普遍，部分地區呈現流行爆發趨勢。因此，發展SPLV-lotus的精確檢測鑒定技術迫在眉睫。RPA是一種新型等溫擴增技術，可以在非實驗室的條件下完成核酸擴增，具有操作簡單、特異性強、靈敏度高、檢測時間短等優點。目前，RPA技術已經被應用于病毒、致病菌、轉基因等領域的檢測。

為了實現本發明目的，本發明首先提供一種甘薯潛隱病毒蓮藕分離物SPLV-lotus重組酶聚合酶擴增(RT-RPA)的檢測試劑盒，其特征在于，包括2條針對SPLV-lotus CP基因設計的特異性引物：

SPLV-lotusRPA-F：GTCAACCATCCGCAACACCACCACAGTCAA；

SPLV-lotusRPA-R：TCTTTGTGGGTATTGCACGCAGCCGAGGTA。