[發明專利]一種包裝飲用水中微生物的靈敏檢測方法

有效

• 申請號: 201910582662.7
• 申請日: 2019-06-28
• 公開（公告）號: CN110272937B
• 公開（公告）日: 2023-05-23
• 發明（設計）人: 羅慧琳;張志剛;鐘華林
• 申請（專利權）人: 華潤怡寶飲料（中國）有限公司
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;G01N15/06
• 代理公司: 深圳市精英專利事務所 44242
• 代理人: 王文伶

本發明涉及飲用水中微生物的檢測技術領域，具體為一種包裝飲用水中微生物的靈敏檢測法，尤其適用于包裝飲用水中銅綠假單胞菌的檢測。本發明通過濾膜分離法、離心分離法等方式將檢測樣品中的潛在微生物有效分離并接種于液體培養基中，結合恒溫振蕩培養方式，增加了檢測的靈敏性，培養8?24h后即可使用光學檢測方法客觀地辨別培養液的濁度差異，從而做出初篩結果的判定，由此評估產品的微生物污染風險，生產企業可更高效地利用產品微生物檢測結果的反饋指導實際生產。

技術領域

本發明涉及飲用水中微生物的檢測技術領域，尤其涉及包裝飲用水中銅綠假單胞菌靈敏檢測方法。

背景技術

微生物污染是影響食品安全的重要因素，也是造成包裝飲用水產品不合格的主要原因，對生產過程及成品進行微生物檢測是風險控制的必要手段。

銅綠假單胞菌是包裝飲用水生產過程中質量控制的關鍵指標菌，銅綠假單胞菌的檢測能力直接關系產品質量的保證。GB?8538-2016《飲用天然礦泉水檢驗方法》中的“銅綠假單胞菌的檢測方法”是針對包裝水銅綠假單胞菌檢測的現行國家標準方法，該方法是基于濾膜法，以瓊脂培養基的方式進行培養，初篩培養24-48h后，對可疑菌落進行鑒定。由于包裝飲用水的成品一般無銅綠假單胞菌污染，初篩培養基上一般無法檢測到菌落生長，但按照該方法要求，需48h后才能依據初篩培養基的菌落情況做出銅綠假單胞菌的初篩結果判定，時間過長，生產企業無法及時利用微生物的檢測結果指導生產。

發明內容

本發明針對現有包裝飲用水微生物如銅綠假單胞菌檢測方法初篩判定耗時長、檢測結果無法實時反饋并指導生產等問題，提供一種應用范圍廣、檢測靈敏度高、初篩判定耗時短的微生物(尤其是銅綠假單胞菌)檢測方法。

為實現上述目的，本發明采用以下技術方案。

一種包裝飲用水中微生物的靈敏檢測方法，包括以下步驟：

S1、微生物的分離采集。對于污染程度較低、采樣體積要求較大的檢測樣品，通過離心分離法、濾膜分離法等方式處理100-1000mL檢測樣品，使得檢測樣品中含量較少的潛在微生物和較大體積的樣液分離，以縮小關注范圍，有效捕獲、采集檢測樣品中的潛在微生物，避免因有限的接種量而影響檢測樣品的代表性，提高檢測結果的準確性。對于污染程度較高、采樣體積要求較小的檢測樣品，亦可通過直接接種等方式，采集檢測樣品中的潛在微生物。同時，以無菌水作為樣品，采用相同的方法處理，作為陰性對照樣。

S2、接種培養。將采集到的微生物轉移接種至50-200mL液體培養基中，與培養液完全充分接觸。將接種后的液體培養基于100-360rpm振蕩培養裝置中，恒定溫度培養。若目標微生物為細菌，則培養溫度為30-42℃；若目標微生物為真菌，則培養溫度為25-30℃。培養條件(培養液、培養溫度、培養轉速、培養時長等)由檢測的目標微生物的特性決定，選擇目標微生物的最適生長條件作為培養條件。陰性對照樣隨同檢測樣品一起，以相同的方式接種和培養。

S3、培養液濁度辨別。將經培養后的陰性對照樣及檢測樣品取出，通過肉眼透過光源直接觀察培養液、使用光學儀器測量培養液濁度值等方式，辨別陰性對照樣及檢測樣品之間的濁度差異，由此判斷檢測樣品是否有微生物繁殖，從而判斷檢測樣品是否受到微生物污染。若確定陰性對照樣無微生物繁殖，則該陰性對照樣有效(稱為有效陰性對照樣)并將其作為參比樣，再比較檢測樣品和陰性對照樣兩者間培養液的濁度差異。若檢測樣品的濁度大于有效陰性對照樣的濁度，則判定該檢測樣品為初篩可疑樣，否則判定該檢測樣品無微生物檢出。

S4、菌落分離純化及鑒定。將初篩可疑樣劃線至瓊脂培養基上，分離培養出單個菌落，通過菌落特征、顯微鏡檢、生化反應等方式鑒定菌落。根據菌落鑒定情況，報告微生物檢出結果。

優選地，所述S1步驟中，離心分離法所用的轉速為2000-8000rpm，時間為2-10min，溫度為4-30℃。

優選地，所述S1步驟中，濾膜分離法所用濾膜為孔徑≤0.45μm的無菌濾膜。