[發(fā)明專利]對稻飛虱不同組織中共生菌Cardinium的分布進(jìn)行定位的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910582506.0
• 申請日: 2019-06-28
• 公開（公告）號(hào): CN110241179B
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 洪曉月;李同浦;周迎春;查思思
• 申請（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6816
• 分類號(hào): C12Q1/6816;C12Q1/689;C12R1/01
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 競存;徐冬濤

1.對稻飛虱不同組織中共生菌Cardinium的分布進(jìn)行定位的方法，其特征在于，包括以下步驟：?（1）稻飛虱組織的解剖和分離：收集稻飛虱成蟲，在顯微鏡下解剖出飛虱組織，并分離到裝有1×PBS的離心管中；所述稻飛虱為白背飛虱或褐飛虱；所述組織為唾液腺、卵巢、精巢、腸道中的一種或多種；?（2）寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)：根據(jù)Cardinium的16S?rRNA序列設(shè)計(jì)出三段具有熒光標(biāo)記的特異性的寡核苷酸探針；所述三段熒光標(biāo)記的具有特異性的寡核苷酸探針為SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2、SEQ?ID?NO.3所示核苷酸序列，?SEQ?ID?NO.1~3用Cy5在寡核苷酸探針序列5’端標(biāo)記；?（3）寡核苷酸探針與稻飛虱組織中Cardinium的雜交：將步驟（1）解剖的組織用4%的多聚甲醛固定，清洗后置于雜交液中過夜，所述雜交液中包括所述寡核苷酸探針，清洗后分別用鬼筆環(huán)肽和DAPI對細(xì)胞骨架和細(xì)胞核染色，再次清洗后用抗熒光淬滅劑封片；?（4）激光共聚焦顯微鏡下的觀察：調(diào)節(jié)激光共聚焦顯微鏡的激發(fā)波長和發(fā)射波長，分別對Cardinium、細(xì)胞骨架和細(xì)胞核掃描，即可對稻飛虱不同組織中共生菌Cardinium的分布準(zhǔn)確定位。

2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的對稻飛虱不同組織中共生菌Cardinium的分布進(jìn)行定位的方法，其特征在于，所述（3）中，寡核苷酸探針與稻飛虱組織中Cardinium的雜交，具體包括以下步驟：?①?4%多聚甲醛固定：用1×PBS將解剖的組織清洗2遍，清除殘余液體，加入1ml的4%多聚甲醛組織固定30min，去除多聚甲醛，再用1×PBS清洗2-3遍；?②核酸雜交液中黑暗過夜：向制備好的核酸雜交液加入三段特異性的寡核苷酸探針，將其加入到裝有組織的離心管中，雜交液沒過組織即可，此操作過程需避光，于46℃水浴鍋中黑暗過夜；?③清洗雜交液：清洗掉雜交液，分別取含有0.015%?DTT的2×SSC，含有0.015%?DTT的1×SSC，含有0.015%?DTT的0.5×SSC各清洗1遍，再用PBS洗1遍，使組織置于離心管底部；?④染細(xì)胞骨架：將鬼筆環(huán)肽用1×PBS?稀釋200倍，向離心管中加入700ml稀釋液進(jìn)行染色，染色時(shí)長為1小時(shí)，然后再用1×PBS清洗3遍，在避光下進(jìn)行操作；?⑤染細(xì)胞核：向離心管中加入DAPI，液體沒過組織即可，置于黑暗中1小時(shí)，用1×PBS清洗3遍，在避光下進(jìn)行操作；?⑥抗熒光淬滅劑封片：將組織置于載玻片上，調(diào)整好位置，加入抗熒光淬滅劑封片。

3.?根據(jù)權(quán)利要求2中所述的對稻飛虱不同組織中共生菌Cardinium的分布進(jìn)行定位的方法，其特征在于，所述②中，配制雜交液的方法，采用如下配方：?核酸雜交液成分配制劑量50%去離子甲酰胺5ml5×SSC3ml200mg/ml?右旋糖酐硫酸酯2.5g250ug/ml?鮭魚精DNA0.003g二硫蘇糖醇0.1mol/l0.154g0.5×Denhardt’s?solution5ml250ug/ml?poly(A)0.003g。

4.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的對稻飛虱不同組織中共生菌Cardinium的分布進(jìn)行定位的方法，其特征在于，所述②中，探針與雜交液的稀釋比例為1：50～200。

5.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的對稻飛虱不同組織中共生菌Cardinium的分布進(jìn)行定位的方法，其特征在于，所述②中探針與雜交液的稀釋比例為1：100。

6.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的對稻飛虱不同組織中共生菌Cardinium的分布進(jìn)行定位的方法，其特征在于，所述（4）中，所采用的激發(fā)光波長和發(fā)射波長為：?Cadinium：Cy5，645～670?nm；?細(xì)胞核：DAPI，359～461?nm；?細(xì)胞骨架：FITC，494～518?nm。