[發明專利]檢測HTT基因CAG三核苷酸重復序列的方法及引物對

在審

• 申請號: 201910577589.4
• 申請日: 2019-06-28
• 公開（公告）號: CN110184344A
• 公開（公告）日: 2019-08-30
• 發明（設計）人: 馮薇;翟瑞雪;智慧芳;倪君君
• 申請（專利權）人: 北京和合醫學診斷技術股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 濟南信達專利事務所有限公司 37100
• 代理人: 李世喆

本發明提供了檢測HTT基因CAG三核苷酸重復序列的方法及引物對，該方法包括：合成引物對，引物對的正向引物的5’端和反向引物的5’端中的至少一端由熒光基團標記；從待測樣本中提取基因組DNA，作為DNA模板；配置包含引物對和擴增模板的PCR擴增體系；對PCR擴增體系進行擴增反應，獲得含有CAG三核苷酸重復序列的PCR產物；毛細管電泳檢測PCR產物，并根據電泳檢測結果計算待測樣本的HTT基因CAG三核苷酸重復數。本方案無需測序即可檢測三核苷酸重復序列。

技術領域

本發明涉及生物檢測技術領域，特別涉及檢測HTT基因CAG三核苷酸重復序列的方法及引物對。

背景技術

亨廷頓舞蹈病(Huntington’s disease，HD)又稱亨廷頓病，是一種隱匿起病，以舞蹈樣不自主運動、精神障礙和癡呆為特征的遺傳性神經系統變性病，為常染色體顯性遺傳。其致病是由位于4號染色體短臂的亨廷頓基因IT15(interesting transcript 15)上的CAG三核苷酸異常擴增突變所致。

HD是常染色體顯性遺傳病，IT15基因(也稱為HD基因或HTT基因)的表達產物為大小約3144個氨基酸的多肽亨廷頓(HTT)蛋白。突變的亨廷頓蛋白含有擴增的谷氨酰胺殘基鏈，病理改變主要局限于中樞神經系統，以尾狀核和殼核(新紋狀體)萎縮最為突出。雖然目前認為HD的發病與突變HTT蛋白的毒性相關，但該病具體的病理生理學機制尚未明確。全世界HD的患病率約為2.7/100 000，發病率約為每年0.38/100 000。歐洲、北美、澳大利亞的患病率約為5.7/100 000，亞洲的患病率約為0.4/100 000。

HTT基因檢測是最重要的輔助檢查，致病基因HTT的CAG重復拷貝數的閾值為36：小于36不致病，36～39不完全外顯；大于39則完全外顯。基因檢測敏感性98.8％，特異性100％。HTT基因中CAG重復拷貝數是發病年齡的主要決定因素，重復拷貝數越高，發病年齡越早。HTT基因也可作為有風險的家族成員的癥狀前檢測，攜帶致病性HTT基因的患者可行產前檢查。

目前國內檢測HD三核苷酸重復次數的方法為，PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈式反應)產物直接測序或切膠回收PCR產物片段直接測序。但由于HTT基因CAG重復片段GC含量高，二級結構復雜，常常難以獲得理想的測序圖，給臨床診斷亨廷頓舞蹈病造成了困難。

發明內容

本發明提供了檢測HTT基因CAG三核苷酸重復序列的方法及引物對，無需測序即可檢測三核苷酸重復序列。

為了達到上述目的，本發明是通過如下技術方案實現的：

首先，本發明提供了檢測HTT基因CAG三核苷酸重復序列的方法，可以包括以下步驟：合成引物對，所述引物對的正向引物的5’端和反向引物的5’端中的至少一端由熒光基團標記；從待測樣本中提取基因組DNA，作為DNA模板；配置包含所述引物對和所述擴增模板的PCR擴增體系；對所述PCR擴增體系進行擴增反應，獲得含有CAG三核苷酸重復序列的PCR產物；毛細管電泳檢測所述PCR產物，并根據電泳檢測結果計算所述待測樣本的HTT基因CAG三核苷酸重復數。

詳細地，利用熒光標記的引物進行PCR擴增時，可以使PCR產物的鏈帶上同樣標記有熒光基團。這種帶有熒光分子的DNA片段在進行毛細管電泳中，可經過激光掃描以熒光吸收峰的方式被記錄下來。進而可基于此來計算待測樣本的HTT基因CAG三核苷酸重復數。

可見，利用熒光標記STR基因分析技術來檢測三核苷酸重復突變情況時，無需對PCR產物進行序列測定即可獲得三核苷酸重復數，故方法簡便、可靠、成本低且易于自動化。

優選地，所述引物對的正向引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.1所示且反向引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.2所示。即：

HTT F：5’-TGAAGGCCTTCGAGTCCCTCAAGTCCTTC-3’