[發明專利]重組惡臭假單胞菌株的構建及其在轉化蘇氨酸合成丙酸中的應用

有效

• 申請號: 201910572968.4
• 申請日: 2019-06-28
• 公開（公告）號: CN112143689B
• 公開（公告）日: 2023-01-03
• 發明（設計）人: 馬超;于波;馬延和;陶勇
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/78;C12P7/52;C12R1/40
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 白艷

本發明公開了重組惡臭假單胞菌株的構建及其在轉化蘇氨酸合成丙酸中的應用。本發明提供了提供的重組菌，為將惡臭假單胞菌KT2440的基因組按照如下改造，其他序列不變，得到重組菌：將所述惡臭假單胞菌KT2440基因組中的prpC基因缺失或者失活、ltaE基因缺失或者失活、bkd基因簇啟動子替換為J23119啟動子、lacI基因缺失或者失活、prpE基因缺失或者失活、rhtA基因缺失或者失活。本發明的實驗證明了本發明得到的重組菌菌株PS11可以實現生產大量丙酸。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種重組惡臭假單胞菌株的構建及其在轉化蘇氨酸合成丙酸中的應用。

背景技術

丙酸及其衍生物在工業上的應用領域十分廣泛，主要應用于食品防腐、飼料儲藏、醫藥中間體合成、農業除草劑合成、有機合成中間體等方面。丙酸的生產方法有化學合成法和微生物發酵法。化學合成法生產丙酸普遍面臨反應條件苛刻、不宜分離純化、容易造成環境污染等問題。而生物轉化法生產丙酸需要建立高轉化率的合成路線，減少副產物的積累，才能降低生產成本，形成具有推廣前景的生產模式。蘇氨酸是一種必需氨基酸，主要通過微生物發酵的方法制備，工藝簡單成本低廉，因此可以作為生產丙酸的原料。

惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)是一種革蘭氏陰性菌，廣泛生長于土壤，水環境及植物根部，能夠分解環境中的一些有機物，從而能夠起到凈化環境的作用，并且具有生物催化、生物排污等有益于人類的功能，被稱為最具有開發潛能的一大類環境益生菌。其中惡臭假單胞菌KT2440(P.putida KT2440)是一株在全世界范圍內得到詳盡研究和應用的菌株，是第一個被美國衛生部重組DNA委員會(Recombinant DNA Advisory Committee，RAC)認定為對環境安全的格蘭氏陰性細菌(1982年),并許可KT2440作為基因工程的宿主菌。

發明內容

為了提供新的制備丙酸的重組菌，本發明提供如下技術方案：

本發明一個目的是提供一種重組菌。

本發明提供的重組菌，為將假單胞菌的基因組按照如下1)-6)所有的方式改造、1)-5)所有的方式改造、1)-4)所有的方式改造、1)-3)所有的方式改造、1)和2)所有方式改造或1)所示的方式改造，其他序列不變，得到重組菌：

1)抑制或降低所述假單胞菌基因組中的甲基檸檬酸合成酶的活性；

2)抑制或降低所述假單胞菌基因組中的蘇氨酸醛縮酶的活性；

3)提高所述假單胞菌基因組中的支鏈酮酸脫氫酶復合物的活性；

4)抑制或降低所述假單胞菌基因組中的乳糖操縱子阻遏蛋白(lacI)的活性；

5)抑制或降低所述假單胞菌基因組中的丙酰輔酶A合成酶的活性；

6)抑制或降低所述假單胞菌基因組中的蘇氨酸/高絲氨酸外排蛋白(rhtA)的活性。

上述重組菌中，所述1)中，所述抑制或降低所述假單胞菌基因組中的甲基檸檬酸合成酶的活性為將所述假單胞菌基因組中的甲基檸檬酸合成酶prpC基因缺失或者失活；目的是減少了丙酸的降解；若lac啟動子和大腸桿菌tdcBC基因插入缺失的prpC位點，則加強了蘇氨酸到2酮丁酸的途徑通路；

所述2)中，所述抑制或降低所述假單胞菌基因組中的蘇氨酸醛縮酶的活性將所述假單胞菌基因組中的ltaE基因缺失或者失活；目的是阻斷了蘇氨酸到甘氨酸的途徑通路；若lac啟動子和大腸桿菌ilvA基因插入缺失的ltaE位點，則再次加強了蘇氨酸到2-酮丁酸的途徑通路；

所述3)中，所述提高所述假單胞菌基因組中的支鏈酮酸脫氫酶復合物的活性將所述假單胞菌基因組中的支鏈酮酸脫氫酶復合物bkd基因簇的啟動子及調控基因bkdR替換為J23119啟動子；目的是加強了2酮丁酸到丙酰輔酶A的途徑通路；