[發明專利]一種細菌固定化方法及應用

在審

• 申請號: 201910572216.8
• 申請日: 2019-06-28
• 公開（公告）號: CN110343692A
• 公開（公告）日: 2019-10-18
• 發明（設計）人: 李篤信;趙磊;張健;張真慶
• 申請（專利權）人: 蘇州大學
• 主分類號: C12N11/10
• 分類號: C12N11/10;C12N11/08;C12P17/06
• 代理公司: 蘇州翔遠專利代理事務所(普通合伙) 32251
• 代理人: 陸金星

本發明公開了一種細菌固定化方法及應用，將LH?52、TM?30、EggerthellaYY7918等三種菌包埋到載體微球上，再將此固定化細菌微球裝填到層析柱中，制成微生物反應器。本發明通過固定化細菌方法，提高了細菌的利用率，而且可以回收重復使用；通過裝入層析柱中，可以用于連續生產。同時，所得到的菌種固定化球生產成本低，菌體附著牢固，菌種具有較高的活性和較長的使用壽命，可高效生產S?雌馬酚。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種細菌固定化方法及應用。

背景技術

大豆異黃酮作為大豆的次級代謝產物，因其廣泛的生物活性，近年來引起了國內外學者的高度重視，由于其具有類似雌二醇的結構，又被稱為“植物雌激素”。大豆異黃酮包括大豆苷(Daidzin)，大豆苷元(Daidzein)，染料木苷(Genistin)，染料木素(Genistein)，黃豆黃素(Glycitin)，黃豆黃素苷元(Glycitein)等化合物，大豆苷元和染料木素為主要成分。S-雌馬酚(S-equol)為大豆苷元的腸道菌群代謝產物，具有類似于大豆異黃酮的生物活性，但生物活性更高，且代謝動力學類型更理性。雌馬酚在預防前列腺癌、乳腺癌、骨質疏松以及更年期綜合征、心臟病和骨質疏松均有一定療效。

研究表明，嚙齒類動物均可代謝大豆異黃酮產生雌馬酚，但對于人類，由于腸道菌群、飲食結構的個體差異，產生雌馬酚的能力均不相同。在西方人群中，只有大約30％的個體能夠產生雌馬酚，而亞洲地區，約有60％的個體可以產生。因此，對于那些無法產生雌馬酚的人，其攝入大豆類制品或大豆異黃酮后所產生的健康效應弱于雌馬酚產生者。目前，雌馬酚的合成途徑主要有兩種，一種是化學合成法，另一種是生物合成法。在化學合成法中，其合成具有操作復雜，時間周期長，產率不高的缺點；半合成中，多以大豆苷元等為原料，雖然合成步驟簡化，產率也有所提高，但產物為消旋體雌馬酚，而R-雌馬酚的生物活性遠遠小于S-雌馬酚。在生物合成法中，可以將大豆苷元全部代謝為S-雌馬酚，轉化率高，但目前存在的方法為擴大目標菌群后與大豆苷元厭氧共培養，具有成本高、菌種無法回收、不適合大生產的缺點。

發明內容

本發明目的是提供一種細菌固定化方法，解決上述問題。

本發明的技術方案是：

一種細菌固定化方法，包括步驟：

(1)菌種的富集：在無菌條件下將LH-52、TM-30、EggerthellaYY7918菌株接種于液體培養基上進行培養，培養結束后，離心收集菌體，洗滌，保存；

(2)菌種的固定化：將所述菌體包埋到載體微球上，獲得固定化的細菌球，用無菌水洗滌；

(3)裝柱與活化：將所述固定化的細菌球裝填到層析柱，獲得固定化細菌柱，用溶液進行活化，制成微生物反應器。

進一步的，步驟(1)中所述液體培養基的成份為蛋白胨、牛肉浸粉、氯化鈉；所述液體培養基的pH為7.2±0.2；所述培養為在37℃下厭氧培養24-48h；所述離心的速度為10000r/min，時間為10min；所述洗滌為用磷酸鹽緩沖液洗滌3次；所述保存溫度為4℃。

進一步的，步驟(2)中所述載體微球為海藻酸鈉、聚乙烯醇、瓊脂、聚丙烯酰胺、殼聚糖、卡拉膠或明膠-戊二醛中的任意一種或多種組合，所述LH-52、TM-30、EggerthellaYY7918菌株分別包埋到多個載體微球上，或者所述LH-52、TM-30、EggerthellaYY7918菌株同時包埋到同一個載體微球上。

進一步的，步驟(2)中所述將所述菌體包埋到載體微球上，獲得固定化的細菌球，用無菌水洗滌具體為：將2％的海藻酸鈉浸泡24h后加熱溶解，取2mL的菌液稀釋2倍，兩者混合均勻，用滴加裝置將其慢慢滴入5％CaCl₂溶液，并用玻璃棒不斷攪拌，冰浴條件下交聯3-6h，獲得固定化的細菌球，過濾后，用無菌磷酸鹽緩沖液洗滌所述固定化的細菌球2-3次，放入冰箱4℃保存。