[發明專利]一種磁珠-PNA探針復合物及富集肝癌循環腫瘤DNA的應用

有效

• 申請號: 201910570959.1
• 申請日: 2019-06-28
• 公開（公告）號: CN110387404B
• 公開（公告）日: 2020-07-28
• 發明（設計）人: 湯佳城;張占豐;唐杰
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/6827
• 分類號: C12Q1/6827;C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

本發明公開了一種磁珠?PNA探針復合物及富集肝癌循環腫瘤DNA的應用，將待測樣本與磁珠?PNA探針復合物雜交反應使待測樣本中未突變基因與磁珠?PNA探針復合物結合形成靶DNA?磁珠?PNA探針復合物，磁分離，獲得含突變基因的上清；PCR無差別擴增含突變基因的上清后構建突變基因文庫并采用分選磁珠純化突變基因文庫，再與捕獲探針雜交反應，雜交產物加入捕獲磁珠，使突變基因結合到捕獲磁珠中，經過洗脫分離，獲得肝癌循環腫瘤DNA。本發明較未經磁珠?PNA探針復合物處理組在肝癌循環腫瘤DNA的檢測靈敏度上提高了10倍以上。

(一)技術領域

本發明涉及一種富集肝癌循環腫瘤DNA中P53基因突變的方法。

(二)背景技術

肝癌是我國第二大癌癥死因，目前肝癌的早期診療薄弱，缺乏準確和靈敏的預警和早診標志物，該狀況導致超過60％的肝癌患者在初次就診時就已進入中晚期，從而失去手術根治的機會。更為嚴峻的是，對肝癌而言即使早期癌灶也可有高轉移潛能，其高復發率與腫瘤大小、生物學特性、側枝循環及栓塞技術、栓塞方式和程度等有關(尤其對于巨塊型肝癌，周圍常伴有影像學難以顯示的微衛星灶及微血管侵犯，導致臨床上所謂的“肝癌根治性手術”本質上卻屬于姑息性切除，術后的殘癌細胞可獲得轉移潛能，引起復發、局部轉移或遠隔器官轉移)。為盡可能早期發現殘癌或復發，為患者爭取適宜的、有效的治療時機，需要能精確監測腫瘤進展的有效的手段，這也是當前國內外學者研究的主要方向。

循環腫瘤DNA檢測技術近年來正逐漸成為國際上具重大潛力的腫瘤診斷新技術。據估算，目前影像學檢測腫瘤的最小閾值為10億個癌細胞，而外周血中循環腫瘤DNA的檢測下限則為1千萬個癌細胞，靈敏度提高了100倍[Regalado A.Spotting cancer in a vialof blood.MIT Technology Review.2014.]。對于其他常見腫瘤，當前針對肝癌循環腫瘤DNA檢測技術的開發還很欠缺，面臨著至少兩個關鍵障礙：(1)肝癌循環腫瘤DNA在血液中的濃度極低，并有其它更高濃度的循環DNA的干擾；(2)肝癌基因變異(包括點突變、刪除、插入、擴增、DNA修飾等)信息復雜而目前已知的信息不全面，檢測的靈敏度及準確率限制了循環腫瘤DNA診斷肝癌的可行性[JiaCheng Tang,YiLi Feng,Tao Guo,AnYong Xie,XiuJunCai.Circulating tumor DNA in hepatocellular carcinoma:Trends andChallenges.Cell Biosci.2016；6:32.]。

(三)發明內容

本發明目的是提供一種磁珠-PNA探針復合物及在富集肝癌循環腫瘤DNA中的應用，該方法可明顯提高含P53 747GT突變的循環腫瘤DNA含量(富集效果在10倍以上)，克服了目前高通量測序平臺因自身儀器錯誤率在檢測突變豐度上的技術瓶頸，同時有效降低測序深度，節約了測序成本，使循環腫瘤DNA中P53基因(747GT)突變檢測有望成為肝癌患者的預警、預防、早診及預后監測的輔助指標，并為其治療過程中靶向藥物選擇及耐藥性進化等研究提供可能的借鑒。

本發明采用的技術方案是：

本發明提供一種磁珠-PNA探針復合物，所述復合物是由磁珠與PNA探針結合而成，所述磁珠包被鏈霉親和素；所述PNA探針的核苷酸序列為：5’-AAC CGG AGG CCC ATC CT-3’，在5’端進行生物素標記。所述PNA探針是以P53基因為模板設計。

進一步，所述磁珠以10mg/ml磁珠緩沖液懸液的形式加入，磁珠粒徑為1.05μm。