[發明專利]一種磁珠-PNA探針復合物及富集肝癌循環腫瘤DNA的應用

有效

• 申請號: 201910570959.1
• 申請日: 2019-06-28
• 公開（公告）號: CN110387404B
• 公開（公告）日: 2020-07-28
• 發明（設計）人: 湯佳城;張占豐;唐杰
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/6827
• 分類號: C12Q1/6827;C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

1.一種磁珠-PNA探針復合物在富集肝癌循環腫瘤DNA中的應用，其特征在于所述應用的方法為：將待測樣本與磁珠-PNA探針復合物雜交反應使待測樣本中未突變基因與磁珠-PNA探針復合物結合形成靶DNA-磁珠-PNA探針復合物，磁分離，獲得含突變基因的上清；PCR無差別擴增含突變基因的上清后構建突變基因文庫并采用分選磁珠純化突變基因文庫，再與捕獲探針雜交反應，雜交產物加入捕獲磁珠中，使突變基因結合到捕獲磁珠中，經過洗脫分離，獲得突變基因，即肝癌循環腫瘤DNA；所述捕獲探針核苷酸序列為：5’-AAC CGG AGTCCC ATC CT-3’；所述磁珠-PNA探針復合物是由磁珠與PNA探針結合而成，所述磁珠包被鏈霉親和素；所述PNA探針的核苷酸序列為：5’-AAC CGG AGG CCC ATC CT-3’，在5’端進行生物素標記。

2.如權利要求1所述的應用，其特征在于所述磁珠以10mg/ml磁珠緩沖液懸液的形式加入。

3.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述磁珠緩沖液懸液按如下方法制備：將包被鏈霉親和素的磁珠以2×BW緩沖液重懸，即為磁珠緩沖液懸液；所述重懸用2×BW緩沖液體積以磁珠重量計為50μl/0.5mg；所述2×BW緩沖液組成為：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，2MNaCl，溶解于超純水，pH＝7.5。

4.如權利要求1所述的應用，其特征在于所述磁珠-PNA探針復合物按如下方法制備：取PNA探針水溶液于99℃變性10分鐘，4℃靜置5分鐘后，與磁珠緩沖液懸液混合，室溫雜交15分鐘，置磁分離架上靜置3分鐘，棄上清，磁珠用1×BW緩沖液洗滌以除去未結合的探針，即得到磁珠-PNA探針復合物；所述PNA探針水溶液與磁珠緩沖液懸液體積比為1:1，所述PNA探針水溶液是將PNA探針用超純水制成20pmol/ul的PNA探針水溶液；所述磁珠緩沖液懸液中磁珠包被有鏈霉親和素，所述磁珠含量為10mg/ml。

5.如權利要求1所述的應用，其特征在于所述應用的方法為：(1)復合物靶向結合未突變基因：將待測樣本于99℃變性10分鐘，4℃靜置5分鐘后，加入磁珠-PNA探針復合物和雜交液構成反應體系，50℃雜交1小時后，靜置磁分離2分鐘，獲得靶DNA-磁珠-PNA探針復合物和含突變基因的上清，實現非突變基因的捕獲；所述待測樣本與磁珠-PNA探針復合物體積比為1:1；所述雜交液補足至反應體系100μL；所述雜交液組成：150mM NaCl，15mM檸檬酸鈉，0.02％Tween-20，溶解于超純水，pH＝7.0；

(2)突變基因文庫的構建：以步驟(1)中含突變基因的上清為模板，以P53-F和P53-R為引物進行PCR反應，并采用全能型DNA建庫試劑盒將PCR產物建庫，獲得突變基因文庫；

P53-F：TTTTCGACATAGTGTGGT；

P53-R：GTCCCAGTAGATTACCACT；

(3)突變基因的捕獲：將步驟(2)突變基因文庫經分選磁珠純化后，加入捕獲探針，渦旋震蕩混勻后于雜交爐中95℃孵育5分鐘，再于47℃孵育16至20小時，利用寡核苷酸分子雜交技術獲得雜交產物；將雜交產物利用捕獲磁珠捕獲突變基因，純化，獲得突變基因，即肝癌循環腫瘤DNA；所述捕獲探針核苷酸序列為：5’-AAC CGG AGT CCC ATC CT-3’。