[發(fā)明專(zhuān)利]一種利用異檸檬酸脫氫酶2評(píng)價(jià)低劑量伽馬射線輻照生物損傷的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910568694.1
• 申請(qǐng)日: 2019-06-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110196320A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-09-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 丁德馨;胡南;易嵐;龍鼎新;趙維超;殷杰;穆紅香;李廣悅
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 南華大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/49
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/49
• 代理公司: 湖南省國(guó)防科技工業(yè)局專(zhuān)利中心 43102
• 代理人: 馮青

1.一種利用異檸檬酸脫氫酶2評(píng)價(jià)低劑量伽馬射線輻照生物損傷的方法，利用C57BL/6J小鼠血清中異檸檬酸脫氫酶2對(duì)低劑量伽馬射線輻照非常敏感的特性，根據(jù)小鼠接受的低劑量伽馬射線輻照劑量與血清中IDH2的相對(duì)表達(dá)量的下調(diào)率的劑量-效應(yīng)關(guān)系，小鼠血清中異檸檬酸脫氫酶2的相對(duì)表達(dá)量的下調(diào)率，評(píng)估低劑量伽馬射線輻照的生物損傷，其特征在于，具體步驟包括：

（1）建立低劑量輻照小鼠模型；

（2）采集血清；

（3）異檸檬酸脫氫酶2相對(duì)表達(dá)量下調(diào)率的檢測(cè)；

（4）輻照損傷綜合評(píng)價(jià)；

所述建立低劑量輻照小鼠模型具體為：

選取6周到7周的雄性小鼠，分組，對(duì)照組小鼠放在無(wú)伽馬射線輻照的環(huán)境中飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組小鼠分別放在劑量率為12.5、25.0和50.0 μGy/h的伽馬射線輻照環(huán)境中飼養(yǎng)，總輻照時(shí)間為90 d，每天輻照8 h；

所述的采集血清具體方法為：

采用摘眼球法取血，采集的血液放置于4^oC冰箱靜置過(guò)夜，隔天3000 r/min離心20 min分離血清；

所述的異檸檬酸脫氫酶2的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)率的檢測(cè)具體方法為：

將收集的接受過(guò)低劑量伽馬射線輻照的小鼠血清進(jìn)行蛋白提取、總蛋白濃度測(cè)定、蛋白質(zhì)變性、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫反應(yīng)、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)、凝膠成像掃描分析、最后進(jìn)行異檸檬酸脫氫酶2的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)率分析。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用異檸檬酸脫氫酶2評(píng)價(jià)低劑量伽馬射線輻照生物損傷的方法，其特征在于，所述蛋白提取具體步驟如下：

淀樣本中的蛋白，去上清，晾干，-80℃保存，干燥后的蛋白質(zhì)團(tuán)塊中加入200-250 μLL3裂解液，反復(fù)吹打直至蛋白質(zhì)分散，超聲助溶，4℃，12000 r/min，離心20 min，吸出上清液，轉(zhuǎn)移至EP管中。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用異檸檬酸脫氫酶2評(píng)價(jià)低劑量伽馬射線輻照生物損傷的方法，其特征在于，

所述總蛋白濃度測(cè)定的具體步驟如下：

將0.2 mg/ml 的BSA 標(biāo)準(zhǔn)品溶液加稀釋液，依次稀釋成0、5、10、20、50、100、150和200μg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后測(cè)定它們?cè)?62 nm下的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后測(cè)定每個(gè)樣品溶液在562 nm下的吸光度值后，再通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中蛋白質(zhì)的濃度。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用異檸檬酸脫氫酶2評(píng)價(jià)低劑量伽馬射線輻照生物損傷的方法，其特征在于，

所述蛋白質(zhì)變性的具體步驟如下：

將蛋白質(zhì)溶液按照4:1的比例加入5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液，沸水浴變性15 min，放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用異檸檬酸脫氫酶2評(píng)價(jià)低劑量伽馬射線輻照生物損傷的方法，其特征在于，

所述凝膠電泳的具體步驟如下：

將30％丙烯酰胺、1.5 M TRIS－HCl、10％SDS、AP和TEMED配制成10%的分離膠和5%的濃縮膠；待分離膠凝固后，在電泳槽中加入電泳液，將變性后的蛋白質(zhì)樣品加入電泳孔中，進(jìn)行電泳，將濃縮膠電壓調(diào)至75 V，分離膠電壓調(diào)至120 V，電泳至溴酚藍(lán)剛跑至分離膠底部，即終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用異檸檬酸脫氫酶2評(píng)價(jià)低劑量伽馬射線輻照生物損傷的方法，其特征在于，

所述轉(zhuǎn)膜的具體步驟如下：

先采用甲醇將PVDF膜進(jìn)行活化，再在膜的底部放置5-6張7×9 cm的濾紙，再一同放置于轉(zhuǎn)膜儀中，加入轉(zhuǎn)膜液，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜半小時(shí)，轉(zhuǎn)膜過(guò)程中，將轉(zhuǎn)膜槽放置于冰水中降溫。