[發(fā)明專利]一種低強度脈沖超聲刺激促進細胞外泌體分泌的方法

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• 申請日: 2019-06-27
• 公開（公告）號: CN110777142A
• 公開（公告）日: 2020-02-11
• 發(fā)明（設計）人: 夏偉梁;曾慶玉;洪士彬;程燚睿;孫俊峰
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N13/00
• 分類號: C12N13/00;C12N5/09;C12N5/071
• 代理公司: 31227 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司
• 代理人: 周一新

本發(fā)明公開了一種低強度脈沖超聲刺激促進細胞外泌體分泌的方法，包括：在37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞，待細胞長至80％，移除培養(yǎng)皿中培液，并沿皿壁加入PBS溶液清洗細胞，并換上無外泌體的胎牛血清培液，將培養(yǎng)皿用封口膜包裹，進行低強度脈沖超聲刺激20分鐘，在超凈臺中去除封口膜，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，收取培養(yǎng)皿中的培液、分離外泌體并進行形態(tài)鑒定，富集外泌體后進行外泌體濃度檢測。通過低強度脈沖超聲刺激促進細胞外泌體分泌，解決傳統(tǒng)依靠細胞分泌外泌體產量低的問題，成本低易于推廣，細胞分泌的外泌體量最高可達150％～200％，且具有正常外泌體的結構和功能，方法簡便安全且高效。

技術領域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)學應用領域，涉及促進細胞外泌體分泌的方法，具體涉及一種低強度脈沖超聲刺激促進細胞外泌體分泌的方法。

背景技術

外泌體是幾乎能由所有細胞分泌的包裹著胞內蛋白以及RNA的脂質雙分子囊泡結構，直徑在30～150nm之間，主要來源于細胞內溶酶體微粒內陷形成的多囊泡體，通過多囊泡體的外膜與細胞膜融合后并被釋放到胞外基質中，在正常生理細胞和病變細胞中起到重要的信息傳輸方式。目前，基于外泌體的生物醫(yī)學治療技術日趨成熟，如利用外泌體的囊泡結構包裹治療藥物可直接靶向病灶治療疾病，并且相對于目前廣泛應用脂質體載藥，外泌體載藥具有生物相容性好、穩(wěn)定性強、免疫排斥性低和易于被細胞吸收等優(yōu)點，然而外泌體的提取條件苛刻并且成本高昂，因此，簡便、快速、成本低的刺激外泌體產量的方法具有重要的社會經濟意義和臨床價值。

外泌體是近幾年的新生科學熱點，其分泌過程還有許多機制尚不清楚，在細胞中調控外泌體的分泌是一個復雜過程：

(1)從外泌體的提取方法看，主流分離技術有超速離心和聚乙二醇沉淀法。超速分離技術將含有外泌體的液體在高達10，000g的超速離心下分離出外泌體，需要超速離心機才能進行，對設備要求苛刻，并且程序繁雜。聚乙二醇沉淀法依靠聚乙二醇和外泌體的結合產生沉淀，離心分離外泌體，但雜質過多，提取周期過長，影響外泌體的進一步應用。

(2)從提取外泌體的原料看，較便宜方便的材料如牛奶，但動物外泌體存在與人類的種屬差異，是否能起到較好的兼容性還需要大量驗證，直接從哺乳動物細胞提取的外泌體由于細胞分泌能力的不同，面臨生產效率低，無法滿足大量生產的需求。

(3)從調控外泌體的手段看，生物法對細胞調控外泌體的關鍵蛋白進行基因改造以調控外泌體分泌面臨著許多尚未攻克的技術難題，化學藥物刺激細胞產生外泌體可能影響分泌的外泌體生物功能。盡管超聲治療在臨床上已廣泛應用，但是物理超聲對細胞外泌體的分泌刺激及其分泌機制還沒有相關研究和報道。

發(fā)明內容

本發(fā)明解決的技術問題是克服現(xiàn)有提取外泌體方法對設備要求苛刻且程序繁雜、雜質過多、提取周期過長，以及生物和化學法調控細胞外泌體存在尚未明確的技術問題，提供一種低強度脈沖超聲刺激促進細胞外泌體分泌的方法，通過低強度脈沖超聲促進細胞分泌外泌體，增加外泌體產量，操作簡單且安全。

本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是：

本發(fā)明的低強度脈沖超聲刺激促進細胞外泌體分泌的方法，具體地，包括以下步驟：

步驟1：在37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞，待細胞長至80％，移除培養(yǎng)皿中培液，并沿皿壁加入PBS溶液清洗細胞，并換上無外泌體的胎牛血清培液；

步驟2：將步驟1的培養(yǎng)皿用封口膜包裹，進行低強度脈沖超聲刺激20分鐘，在超凈臺中去除封口膜，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時；其中，所述低強度脈沖超聲的超聲強度小于5W/cm²；

步驟3：收取步驟2培養(yǎng)皿中的培液，超速離心分離外泌體并進行形態(tài)鑒定；

步驟4：富集步驟3所得外泌體；其中，所述低強度脈沖超聲的超聲強度小于5W/cm²。