[發(fā)明專利]天然組織來源的脫細(xì)胞骨膜基質(zhì)凝膠材料的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910567114.7
• 申請日: 2019-06-27
• 公開（公告）號: CN110237303B
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 林賢豐;邱朋程;范順武
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院;浙江狄賽生物科技有限公司
• 主分類號: A61L27/22
• 分類號: A61L27/22;A61L27/36;A61L27/52;A61L27/54
• 代理公司: 杭州君度專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 33240
• 代理人: 楊舟濤

1.天然組織來源的脫細(xì)胞骨膜基質(zhì)凝膠材料的制備方法，其特征在于：

a)將初步去除骨膜周邊肌肉、筋膜和脂肪作為原材料；

b)將骨膜組織材料用無菌水漂洗3次，每次20分鐘，去除殘余的肌肉、筋膜和脂肪組織，用24kGy劑量的γ射線照射24h，殺滅存在的細(xì)菌和病毒；

c)將b)得到的材料經(jīng)磷酸三丁酯與去離子水處理12-24小時；磷酸三丁酯與去離子水的體積比為1%-5%；

d)將c）得到的材料浸泡于濃度為1%TritonX-100溶液中，恒溫23°C搖床200rpm震蕩12小時，用無菌水漂洗3次，每次20分鐘，去除殘留TritonX-100溶液；

e)將d）得到的材料浸泡于摩爾濃度為1%SDS溶液中，恒溫23°C搖床200rpm震蕩2小時，用ddH₂O流動沖洗12小時，去除殘留SDS溶液；

f)將e）得到的材料浸泡于含KCl的PBS緩沖液中8小時，KCl的濃度為2M；

g)將f）得到的材料浸泡于含KI的PBS緩沖液中10小時，KI的濃度為2M，ddH₂O流動沖洗12小時去除殘留PBS緩沖液；

h)將g）得到的材料輻照滅菌；

將g）得到的材料經(jīng)γ射線照射10-48小時，殺滅可能存在的細(xì)菌和病毒；

i)將h）得到的材料冷凍干燥；

將滅菌后的材料先放入-80℃冰箱預(yù)冷后，放入冷凍干燥機(jī)干燥24小時，保持真空度為1.5mtorr，溫度-50℃；

j)將i）得到的材料磨粉

將凍干的材料轉(zhuǎn)移到研磨器中，研磨機(jī)頻率為60HZ，設(shè)定時間1分鐘，經(jīng)液氮冷凍，研磨成粉末，過40-100目篩網(wǎng)，收集凍干組織粉末；

k)將j）得到的材料凝膠；

將j）得到的粉末浸泡于冰醋酸溶液中，加入胃蛋白酶，常溫消化24-72小時，待完全消化，溶液500×g離心10min，去除雜質(zhì)后用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.4，即得脫細(xì)胞骨膜基質(zhì)凝膠材料，4℃保存；所述的脫細(xì)胞骨膜基質(zhì)凝膠材料能促生物礦化活性，具有成骨誘導(dǎo)活性，有利于體內(nèi)成骨修復(fù)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分化，促進(jìn)體內(nèi)血管生成。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然組織來源的脫細(xì)胞骨膜基質(zhì)凝膠材料的制備方法，其特征在于：將所得脫細(xì)胞骨膜基質(zhì)凝膠材料使用交聯(lián)劑增加凝膠纖維網(wǎng)絡(luò)的交聯(lián)度，交聯(lián)劑為EDC和NHS。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然組織來源的脫細(xì)胞骨膜基質(zhì)凝膠材料的制備方法，其特征在于：h）中的輻照劑量為5-40kGy。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然組織來源的脫細(xì)胞骨膜基質(zhì)凝膠材料的制備方法，其特征在于：k)中所述的冰醋酸濃度為0.3-0.7M。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然組織來源的脫細(xì)胞骨膜基質(zhì)凝膠材料的制備方法，其特征在于：選擇80目篩網(wǎng)篩過組織顆粒。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然組織來源的脫細(xì)胞骨膜基質(zhì)凝膠材料的制備方法，其特征在于：胃蛋白酶加入量為占總?cè)芤旱?-20%。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的天然組織來源的脫細(xì)胞骨膜基質(zhì)凝膠材料的制備方法，其特征在于：EDC的體積濃度為0.1-0.4%，EDC：NHS比例為2:1，3:1，3:2，4:3，5:3。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然組織來源的脫細(xì)胞骨膜基質(zhì)凝膠材料的制備方法，其特征在于：所述制備方法還包括脫細(xì)胞骨膜基質(zhì)凝膠材料交聯(lián)生長因子的步驟，引入生物活性因子接枝于凝膠膠原纖維網(wǎng)絡(luò)，生物活性因子為VEGF或FGF。