[發(fā)明專利]天然組織來源的脫細(xì)胞骨膜基質(zhì)凝膠材料的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910567114.7
• 申請日: 2019-06-27
• 公開（公告）號: CN110237303B
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林賢豐;邱朋程;范順武
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院;浙江狄賽生物科技有限公司
• 主分類號: A61L27/22
• 分類號: A61L27/22;A61L27/36;A61L27/52;A61L27/54
• 代理公司: 杭州君度專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 33240
• 代理人: 楊舟濤

本發(fā)明公開了一種天然組織來源的脫細(xì)胞骨膜基質(zhì)凝膠材料的制備方法，本發(fā)明將哺乳動物來源的脫細(xì)胞骨膜基質(zhì)通過冷凍干燥，最大化保留生物活性分子；并將其研磨成粉、控制粉末粒徑，增加溶液接觸面積從而加速消化，得到具有良好成骨活性潛力的標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一化的脫細(xì)胞骨膜基質(zhì)凝膠。此外，通過EDC交聯(lián)生長因子，對實(shí)現(xiàn)新生骨組織的優(yōu)異再生、血管化長入具有很好的促進(jìn)效果?？捎糜谛迯?fù)臨床上各類病因造成的骨缺損，骨不愈合等多種骨再生障礙問題。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于骨組織修復(fù)及其再生技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及天然組織來源的脫細(xì)胞骨膜基質(zhì)凝膠材料的制備方法。

背景技術(shù)

骨缺損是臨床常見疾病，往往會造成骨不連接、延遲愈合或不愈合及局部功能障礙，對患者造成痛苦，導(dǎo)致其行動受限，生活質(zhì)量受到嚴(yán)重影響。傳統(tǒng)人工合成材料雖然能提供足夠的力學(xué)支撐，但其生物活性差，骨誘導(dǎo)性不足，不易降解，甚至引起異物反應(yīng)。目前，治療骨缺損和骨壞死等的方法以自體骨移植和同種異體骨移植為主，但自體骨移植會產(chǎn)生二次損傷，而同種異體骨移植因存在潛在免疫和疫病傳播風(fēng)險(xiǎn)，因此亟需研發(fā)新的具有良好骨愈合再生修復(fù)效果的骨組織工程材料。

細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)是由細(xì)胞合成并分泌到胞外的大分子，主要成分包括膠原纖維、糖蛋白、多聚糖、生長因子等。ECM構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，支持并連接組織結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)組織細(xì)胞的生長等系列生理活動。水凝膠是組織工程中一類較受關(guān)注的支架材料體系，具有可注射，損傷小，任意塑形等優(yōu)點(diǎn)。而常見的水凝膠產(chǎn)品有單一或少數(shù)特定成分構(gòu)成，難以完美模擬生物組織成分，若負(fù)載另外的生長因子或活性分子，有產(chǎn)生副效應(yīng)和致瘤等風(fēng)險(xiǎn)。申請?zhí)枮?01410145791.7的專利公開了一種脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠及其制備新方法，脫細(xì)胞、消化后通過較低溫恒溫孵育減少了對組織的損傷。申請?zhí)枮?01811452768.7的專利公開了一種脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠制備的方法，除了采用溫和的脫細(xì)胞法，還在脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠消化后，在加壓條件下進(jìn)行處理，獲得了較好修復(fù)效果。

但既往脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠材料的制備通過剪碎方式無法獲得足夠的比表面積，不利于消化液的充分接觸，生物活性物質(zhì)保留低。此外，目前并未有骨膜ECM凝膠標(biāo)準(zhǔn)化制備的產(chǎn)品。骨膜是骨的重要組成部分，骨膜ECM的組織特異性更有利于骨的再生修復(fù)，是其他異位組織作為修復(fù)材料所無法取代的。因此，基于上述背景，本專利提出一種通過冷凍干燥的方案實(shí)現(xiàn)對骨膜ECM活性分子的最大保留；并且將ECM研磨成粉增加溶液接觸面積；通過篩網(wǎng)過濾控制粉末粒徑，標(biāo)化消化步驟。從而得到具有生物活性高保留、標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一化的骨膜ECM凝膠修復(fù)材料。此外，通過EDC交聯(lián)生長因子，對實(shí)現(xiàn)新生骨組織的優(yōu)異再生、血管化長入具有很好的促進(jìn)效果。可用于修復(fù)臨床上各類病因造成的骨缺損，骨不愈合等多種骨再生障礙問題。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種生物活性物質(zhì)高保留的脫細(xì)胞骨膜基質(zhì)凝膠材料及其制備方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：對天然組織來源的骨膜組織經(jīng)脫細(xì)胞處理后，通過冷凍干燥、磨粉、凝膠處理，得到高活性的骨膜ECM凝膠材料。并通過修飾膠的技術(shù)，引入生物活性因子(VEGF、FGF)，將其接枝于凝膠膠原纖維網(wǎng)絡(luò)，實(shí)現(xiàn)特定功能的組合。

所述的天然組織來源的骨膜組織包括哺乳動物骨組織骨膜為四肢長骨骨膜以及顱骨骨膜；所述的脫細(xì)胞技術(shù)包括蛋白酶抑制劑、KCl、KI、丙酮、磷酸三丁酯、Triton X-100、十二烷基硫酸鈉(SDS)等化學(xué)試劑和物理凍融法組成的脫細(xì)胞方案，具體包括以下步驟：

a)將初步去除骨膜周邊肌肉、筋膜和脂肪作為原材料；

b)將骨膜組織材料用無菌水漂洗3次，每次20分鐘，去除殘余的肌肉、筋膜和脂肪，用24kGy劑量的γ射線照射24h，殺滅存在的細(xì)菌和病毒；

c)將b)得到的材料經(jīng)磷酸三丁酯與去離子水處理12-24小時(shí)；磷酸三丁酯與去離子水的體積比為1％-5％；