[發明專利]一種通過羽色結合分子遺傳標記鑒別PGC移植后代雞的鑒定方法

在審

• 申請號: 201910563547.5
• 申請日: 2019-06-26
• 公開（公告）號: CN110283894A
• 公開（公告）日: 2019-09-27
• 發明（設計）人: 左其生;金晶;李碧春;趙瑞豐;李婷婷;袁霞;靳鍇
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;A01K67/027
• 代理公司: 揚州蘇中專利事務所(普通合伙) 32222
• 代理人: 沈志海

本發明涉及一種通過羽色結合分子遺傳標記鑒別PGC移植后代雞的鑒定方法，屬于生物技術領域。為了解決PGC移植后代的鑒別問題，本發明采用后代雞羽色和微衛星標記分析的方法成功對后代雞的遺傳來源進行鑒別。本發明適用于禽類的種質資源的保護和物種復原，本發明可行性強，鑒定準確，成本低。能夠有效鑒別后代雞的遺傳組成，為基因編輯模型雞生產提供技術支持。

技術領域

本發明涉及一種新的通過羽色結合分子遺傳標記鑒別PGC移植后代雞的鑒定方法，屬于生物技術領域。

背景技術

在哺乳動物的上通過精子或者卵子的胚胎冷凍技術結合單精注射技術能夠進行種質資源保存，但由于鳥類卵生的特點，使得這一方法在鳥類上難以進行應用。由于雞卵生的特點，通過在2.5天雞胚血管移植PGC制備生殖嵌合雞是產生供體細胞后代的主要方法。

發明內容

本發明旨在克服PGC血管移植后產生后代的鑒別問題，發明出一種既直觀又準確的雞PGC移植后代的鑒別方法，即一種通過羽色結合分子遺傳標記鑒別PGC移植后代雞的鑒定方法。

本發明的技術方案如下：

一種通過羽色結合分子遺傳標記鑒別PGC移植后代雞的鑒定方法，其特征是，以黑羽狼山雞為供體，隱性白羽雞為受體，在孵化2.5天隱性白羽雞的雞胚血管中移植黑羽狼山雞的PGC，受體雞孵化飼養至性成熟，群內自交產生后代。通過黑白羽色結合微衛星標記鑒別生殖配子的來源。

為了解決PGC移植后代的鑒別問題，本發明采用后代雞羽色和微衛星標記分析的方法成功對后代雞的遺傳來源進行鑒別。本發明適用于禽類的種質資源的保護和物種復原，本發明可行性強，鑒定準確，成本低。能夠有效鑒別后代雞的遺傳組成，為基因編輯模型雞生產提供技術支持。

具體實施方式

本發明中所需原材料有：孵化至4.5天的狼山雞雞胚，孵化至2.5天的隱性白羽雞雞胚。金牌Mix(擎科)，基因組提取試劑盒(天根)，LEI094PCR擴增引物：上游CAGGATGGCTGTTATGCTTCCA，下游GACCATACTTCTGGAACAAG。

培養液：43.5ml KO-DMEM培養基，5％FBS(體積濃度)，1％雞血清(體積濃度)，1％青鏈霉素(體積濃度)，0.4％非必須氨基酸(體積濃度)，0.2μlβ-巰基乙醇，100μl hSCF(5ng/ml),100μl bfgf(10ng/ml),50μl LIF。

一種通過羽色結合分子遺傳標記鑒別PGC移植后代雞的鑒定方法，具體做法如下：

(1)在體式顯微鏡下分離孵化至4.5天的狼山雞雞胚生殖嵴，胰酶消化三分鐘，加入培養液終止消化,400目濾布過濾后以1400轉/分鐘，離心8分鐘，棄上清，加入3ml培養液差速貼壁40分鐘兩次收集細胞懸液。

(2)將收集好的細胞懸液進行細胞計數，調整細胞濃度為3000個細胞/μl，注射1μl進2.5天的隱性白羽雞雞胚血管中。

(3)將注射有狼山雞PGC的隱性白羽雞種蛋孵化并飼養至性成熟。

(4)將飼養至性成熟的隱性白羽雞進行群內自交，得到后代。

(5)觀察后代羽色(以翅根羽色為準)，黑色為陽性雞即狼山雞供體細胞后代，白色為陰性雞即受體雞后代。

(6)采20μl以上的陽性雞血液，提取基因組。

(7)PCR擴增LEI094片段，PCR體系如表1，PCR擴增程序如表2：

表1 LEI094PCR反應體系