[發(fā)明專利]一種短串聯(lián)重復(fù)序列通用探針及其設(shè)計(jì)方法和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910559128.4
• 申請(qǐng)日: 2019-06-26
• 公開（公告）號(hào): CN110343757A
• 公開（公告）日: 2019-10-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱海濤;李旭新;夏江
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 領(lǐng)航基因科技（杭州）有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6883
• 分類號(hào): C12Q1/6883;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 陸惠中;田歡

本發(fā)明涉及體外診斷領(lǐng)域，具體涉及一種用于同時(shí)檢測(cè)基因組多個(gè)位點(diǎn)的通用探針和引物設(shè)計(jì)方法及其應(yīng)用試劑盒。所述通用探針采用短串聯(lián)重復(fù)序列作為骨架序列，解決了拷貝數(shù)濃度放大的反應(yīng)體系內(nèi)探針數(shù)量過多，易于形成非特異性擴(kuò)增及合成成本高昂的問題。通過在待測(cè)染色體單拷貝基因片段通用探針位置的兩側(cè)設(shè)計(jì)多對(duì)引物，實(shí)現(xiàn)了染色體拷貝數(shù)濃度的等比例放大，尤其適用于某些極低濃度樣品的檢測(cè)(例如無創(chuàng)檢測(cè)染色體拷貝數(shù)是否發(fā)生變異)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及體外診斷領(lǐng)域，具體涉及一種短串聯(lián)重復(fù)序列通用探針及其設(shè)計(jì)方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

20世紀(jì)80年代后期，Marshfield醫(yī)學(xué)研究基金會(huì)的James和俄勒岡健康科學(xué)大學(xué)的Wis等人分離出來一種比小衛(wèi)星DNA具有更短重復(fù)單元的衛(wèi)星DNA，被稱作微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA)、短串聯(lián)重復(fù)(Short Tandem Repeats,STRs)或簡(jiǎn)單序列重復(fù)(Simple Sequence Repeats,SSRs)，每個(gè)重復(fù)單元長(zhǎng)度在1～6bp之間。STR符合孟德爾遺傳模式，共顯性表達(dá)，廣泛分布于真核生物的基因組中。按照重復(fù)基序可以分為3種類型：?jiǎn)我恍?如(AC)n)、復(fù)合型(如(AC)m (AG)n)和間斷型(如(AC)m T(AG)n)。按照重復(fù)的堿基數(shù)，又可以分為單堿基重復(fù)(如(A)n)，雙堿基重復(fù)(如(AC)n)，三堿基重復(fù)(如(ATC) n)，多堿基重復(fù)(如((ATCT)n、(ACATG)n、(ATGATG)n等)。

無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)(NIPT)是利用新一代高通量測(cè)序(NGS)檢測(cè)胎兒染色體異常的檢測(cè)技術(shù)。通過采集孕婦外周血，對(duì)母體外周血中的游離DNA片段 (包括胎兒游離DNA)進(jìn)行測(cè)序，結(jié)合生物信息分析，計(jì)算胎兒患染色體非整倍體的風(fēng)險(xiǎn)。該技術(shù)比傳統(tǒng)的血清學(xué)篩查更準(zhǔn)確，比容易造成流產(chǎn)的羊水穿刺更安全。然而，基于NGS的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)存在著檢測(cè)周期長(zhǎng)、技術(shù)門檻高、檢測(cè)費(fèi)用高等不足，阻礙了其成為普查項(xiàng)目。

數(shù)字PCR(Digital PCR，dPCR)是一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)。其核心是基于泊松分布的原理，將核酸樣品分散到幾萬個(gè)微孔的芯片中或者包被于液滴中，分散成納升級(jí)的擴(kuò)增體系，通過大規(guī)模單分子擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)拷貝數(shù)的絕對(duì)定量。該技術(shù)避免了傳統(tǒng)熒光定量PCR(Quantitative PCR，qPCR)的相對(duì)定量步驟，直接獲知目標(biāo)核酸分子的拷貝數(shù)濃度，提高了檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度。數(shù)字PCR技術(shù)用于無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)，單一位點(diǎn)的拷貝數(shù)很低，難以達(dá)到最佳的檢測(cè)范圍，因此需要進(jìn)行多個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)后取總拷貝數(shù)進(jìn)行分析。目前的數(shù)字PCR探針設(shè)計(jì)需要考慮堿基序列的因素，比較復(fù)雜而且成本高昂。因此，急需發(fā)明一種新型的可應(yīng)用于無創(chuàng)檢測(cè)染色體拷貝數(shù)是否發(fā)生變異的數(shù)字PCR通用探針。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明公開了一種新型的用于數(shù)字PCR的通用探針，具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、制備成本低等優(yōu)點(diǎn)。具體技術(shù)方案如下：

本發(fā)明第一個(gè)方面公開了一種用于數(shù)字PCR的探針，所述探針的序列采用短串聯(lián)重復(fù)序列作為骨架序列，所述短串聯(lián)重復(fù)序列按照重復(fù)基序區(qū)分，包括單一型(用結(jié)構(gòu)式(X)n表示)、復(fù)合型(用結(jié)構(gòu)式(X)n(Y)m表示)和間斷型 (用結(jié)構(gòu)式(X)n Z(Y)m表示)，其中X為A、C、G、T四種堿基中的一種或 2-6個(gè)堿基組合，Y為A、C、G、T四種堿基中不同于X的一種或2-6個(gè)堿基組合， Z為A、C、G、T四種堿基中不同于X和Y的一種或多個(gè)堿基的組合，n和m為重復(fù)的單元數(shù)。

優(yōu)選的，所述探針的長(zhǎng)度為8-40bp；探針的5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，探針的 3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)。

更優(yōu)選的，所述熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM、VIC、ROX或CY5，所述熒光淬滅基團(tuán)為MGB。

應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的熒光報(bào)告基團(tuán)并不限于FAM、VIC、ROX或CY5，本發(fā)明的熒光淬滅基團(tuán)并不限于MGB，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)需要能夠選擇任何合適的熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)來完成本發(fā)明，并且在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。