[發明專利]腎移植供體特異性尿源細胞及其DNA的制備方法以及其應用

在審

• 申請號: 201910558698.1
• 申請日: 2019-06-26
• 公開（公告）號: CN110305835A
• 公開（公告）日: 2019-10-08
• 發明（設計）人: 王長希;劉龍山;李希芮;韋勇成;蘇曉均
• 申請（專利權）人: 中山大學附屬第一醫院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N15/10;C12Q1/6869
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 程躍華

本發明涉及腎移植供體特異性尿源細胞及其DNA的制備方法以及其在腎移植供體基因組學背景分析中的應用。本發明尿源細胞的制備方法包括以下步驟：(1)取腎移植受體的中段尿，離心，棄上清；(2)向離心所得下層沉淀中加入含有青鏈霉素混合液或原代細胞抗生素的磷酸鹽緩沖液進行重懸，然后再次離心，棄上清；(3)向離心所得下層沉淀中加入尿源細胞培養基，重懸，得到細胞懸液；(4)將所得細胞懸液接種于培養容器中，進行細胞體外擴增，得到腎移植供體特異性尿源細胞。本發明基于腎移植術后受體尿液獲取的供體特異性尿源細胞，獲得供體DNA，進行供體基因組學背景分析，其安全無創、成本低廉且分離效率高，易于獲得足夠數量的DNA。

技術領域

本發明涉及一種腎移植供體特異性尿源細胞及其DNA的制備方法及其在腎移植供體基因組學背景分析(如HLA高分辨率分型檢測等)中的應用，屬于生物醫藥技術領域。

背景技術

腎移植作為終末期腎臟疾病的最優治療方案，被廣泛應用于臨床。然而，移植后受體對移植物產生的免疫反應可能造成包括急慢性免疫排斥、移植物失功等在內的多種不良預后，嚴重影響移植效果^[1]。而明確的供體基因組學背景，對預防及治療各種移植術后不良事件的發生，有重要意義。而在基因組學背景中，以供體人白細胞抗原(HLA)的基因型背景對術后不良事件的影響最大。

人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)是人類的主要組織相容性復合體，控制機體識別“自身”和“異己”的過程，參與異體抗原提呈，啟動特異的免疫反應。然而在識別異己的同時，它也成為了異體器官移植的主要障礙，是決定移植排斥水平的重要因素。在器官移植時，供體和受體HLA相容程度越高，排斥水平越低，移植成功率和移植物長期存活率越高；反之，則容易發生排斥反應，移植物功能損傷越嚴重^[2]。因此，獲取供受體雙方的HLA分型，鑒定HLA的基因型構成，可明確供受體之間的HLA差異，進而科學的決定器官分配。

早期HLA的檢測包含血清學檢測，如淋巴細胞毒實驗；隨著分子技術的進步，逐漸過渡到基于多聚酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)的DNA序列分析分子診斷為主導，包含PCR序列特異引物(PCR-SSP)和PCR序列特異的寡核苷酸引物(PCR-SSO)方法^[3]。隨著高通量測序技術的發展，采用高通量測序技術獲取HLA基因高分辨率分型結果被認為是最可靠的標準。HLA高分辨率分型結果包含3種Ⅰ類HLA(HLA-A，HLA-B，HLA-C)和三種Ⅱ類HLA(HLA-DR，HLA-DQ，HLA-DP)的基因型信息。這一技術推動了器官移植供受者選擇系統的發展，使兩者的匹配達到更為精準的層面^[4]。

通過對供體特異性的HLA高分辨率分型結果分析，可以獲取供體特異性的抗原表位(epitope)。這種篩選相對于傳統血清學反應模式，將提供一個更科學可用的匹配系統，大大提高了配型的精度，從而提高術后移植物功能和患者生存質量^[5-8]。

同時，明確供體的HLA高分辨分型對于器官移植患者術后管理意義重大。供體特異性抗體(donor specific antibody,DSA)介導的排斥反應(antibody-mediatedrejection，AMR)是導致移植物遠期失功的首要危險因素。AMR的診斷和治療效果評價依賴于明確DSA位點。臨床上，首先檢測受者外周血的群體反應性抗體(panel reactiveantibodies，PRA)，然后結合和比對供體HLA高分辨分型結果，來最終判定DSA位點，明確AMR的診斷，調整后續治療。