[發明專利]腎移植供體特異性尿源細胞及其DNA的制備方法以及其應用

在審

• 申請號: 201910558698.1
• 申請日: 2019-06-26
• 公開（公告）號: CN110305835A
• 公開（公告）日: 2019-10-08
• 發明（設計）人: 王長希;劉龍山;李希芮;韋勇成;蘇曉均
• 申請（專利權）人: 中山大學附屬第一醫院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N15/10;C12Q1/6869
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 程躍華

1.一種腎移植供體特異性尿源細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)取腎移植受體的中段尿，離心，棄上清；

(2)向步驟(1)離心所得下層沉淀中加入含有青鏈霉素混合液或原代細胞抗生素的磷酸鹽緩沖液進行重懸，然后再次離心，棄上清；

(3)向步驟(2)離心所得下層沉淀中加入尿源細胞培養基，重懸，得到細胞懸液；

(4)將步驟(3)所得細胞懸液接種于培養容器中，進行細胞體外擴增，得到腎移植供體特異性尿源細胞。

2.如權利要求1所述的腎移植供體特異性尿源細胞的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中，尿源細胞培養基含有下述組分：REGM培養基、DMEM-high Glucose培養基、非必需氨基酸細胞培養添加物、GlutaMAX添加劑和胎牛血清。

3.如權利要求1所述的腎移植供體特異性尿源細胞的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)中，培養容器經明膠溶液包被處理。

4.如權利要求1所述的腎移植供體特異性尿源細胞的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)中，細胞體外擴增的方法為：將細胞懸液接種于培養容器中后，先置于培養箱內靜置培養，然后更換新鮮尿源細胞培養基，繼續培養至細胞匯合度達到60％-80％，再用EDTA胰酶消化傳代，將細胞擴增至所需的數量。

5.一種腎移植供體特異性尿源細胞DNA的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(a)采用權利要求1～4任一項所述方法制備數量不低于1×10⁶的腎移植供體特異性尿源細胞；

(b)從腎移植供體特異性尿源細胞中提取DNA，得到腎移植供體特異性尿源細胞DNA。

6.如權利要求5所述的腎移植供體特異性尿源細胞DNA的制備方法，其特征在于，所述步驟(b)中，從腎移植供體特異性尿源細胞中提取DNA的方法包括以下步驟：

(b1)采用EDTA胰酶對腎移植供體特異性尿源細胞進行消化，終止消化后加入磷酸鹽緩沖液重懸細胞，得到細胞懸液；

(b2)向步驟(b1)所得細胞懸液中加入RNA酶A和蛋白酶K進行處理，然后加入無水乙醇，振蕩混勻，出現絮狀沉淀；

(b3)將步驟(b2)所得溶液和絮狀沉淀均加至吸附柱中，離心，去除廢液，再采用漂洗液清洗吸附柱至少一次，然后將洗脫緩沖液加至吸附柱的吸附膜中間部位，放置后離心，收集洗脫緩沖溶液，得到腎移植供體特異性尿源細胞DNA。

7.如權利要求1～4任一項所述方法制備得到的腎移植供體特異性尿源細胞或如權利要求5或6所述方法制備得到的腎移植供體特異性尿源細胞DNA在腎移植供體基因組學背景分析中的應用；優選地，所述基因組學背景分析為HLA分型分析。

8.一種腎移植供體HLA分型的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：采用權利要求5或6所述方法制備腎移植供體特異性尿源細胞DNA，檢測所得DNA中HLA分型，得到腎移植供體HLA分型結果。

9.如權利要求8所述的腎移植供體HLA分型的檢測方法，其特征在于，所述檢測所得DNA中HLA分型的方法為：采用高通量測序檢測所得DNA中HLA高分辨率分型，得到腎移植供體HLA高分辨率分型結果。

10.如權利要求9所述的腎移植供體HLA分型的檢測方法，其特征在于，所述高通量測序檢測所得DNA中HLA高分辨率分型的方法為：先進行HLA-A/B/C/DRB1/DQB1/DPB1位點基因擴增并匯集擴增子序列，然后進行酶切修飾，將每個樣本添加“條碼”信息，再進行高通量測序，分析測序所得數據，得到腎移植供體HLA高分辨率分型結果；優選地，所述HLA-A/B/C/DRB1/DQB1/DPB1位點基因擴增采用的試劑盒為NGSgo-AmpX試劑盒；所述酶切修飾采用的試劑盒為NGSgo LibrX試劑盒；所述添加“條碼”信息采用的試劑盒為NGSgo-Indx試劑盒。