[發明專利]使用校正因子的顯微成像方法

有效

• 申請號: 201910558190.1
• 申請日: 2019-06-25
• 公開（公告）號: CN110658617B
• 公開（公告）日: 2023-10-20
• 發明（設計）人: V.德雷舍;N.蘭霍爾茲
• 申請（專利權）人: 卡爾蔡司顯微鏡有限責任公司
• 主分類號: G02B21/00
• 分類號: G02B21/00
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 王蕊瑞

本發明涉及顯微成像方法，其包含以下步驟：用照明輻射照明樣品(1)并沿著檢測軸線捕獲檢測輻射，所述檢測輻射已經由照明輻射引起，在第一次時作為寬場信號(WF)且在第二次時作為復合信號(CI)，所述復合信號已經由共焦圖像和寬場圖像的疊加來形成；通過從復合信號(CI)減去寬場信號(WF)來提取共焦圖像，其中使用校正因子。所述方法的特征在于，為每個執行的成像和/或為每個成像的樣品(1)確定當前校正因子，并且使用相應的當前校正因子來提取共焦圖像。

技術領域

本發明涉及根據獨立權利要求的前序部分的顯微成像方法。

背景技術

在顯微術的技術領域中(例如在生物/技術樣品或樣品區域的高分辨率三維表示中)，現有的問題在于用照明輻射的最低可能的強度照射樣品，而同時具有可用于高分辨率檢測和成像的高強度的檢測輻射。同時，提供圖像數據并隨后成像應該在最短可能的時間內實現，理想地實時地來實現。

DE 10 2014 004 249 A1已經公開了相關的旋轉盤顯微術的方法。在通過其中公開的相關的旋轉盤顯微術來確定樣品的形貌的方法中，執行以下步驟：在交替捕獲放置在物體臺上的樣品的第一圖像和第二圖像期間，存在物體臺和/或聚焦驅動器的垂直移動。在該過程中，垂直聚焦位置被儲存為每個圖像的元數據。在其他步驟中插值兩個第一圖像和兩個第二圖像，并且獲得中間圖像或中介圖像。出于為某一垂直位置產生共焦圖像的目的，中介圖像通過計算與所述位置處的第二圖像或第一圖像組合。

從WO 97/31282 A1已知，出于產生復合圖像和非共焦圖像的目的，在照明和/或檢測束路徑中使用適當的掩模。通過從這兩個圖像類型計算，由適當的組合來提取共焦圖像。這允許非常快速的成像。同時，使用高比例的檢測光，所以用低強度的照明輻射照明樣品是足夠的。

Neil等人(Neil，M.A.A等人，(1997)，A light efficient optically sectioningmicroscope；Journal of Microscopy 189：114-117)和Wilson等人(Wilson，T.等人，(1996)，Confocal microscopy by aperture correlation；OPTICS LETTERS 21：1879-1881)的出版物同樣提出了這樣的可能性：通過其可以從復合圖像和寬場圖像中提取共焦信號。

當計算共焦圖像時，可以使用以下公式：

共焦信號＝(復合信號)-n×(寬場信號)。

在此，因子n是為成像系統確定一次并在沒有改變的情況下應用的校正因子，并且因子n獨立于樣品。校正因子用于補償系統相關的偏差，例如復合信號和寬場信號的光路徑的不同傳輸值。使用該進程，例如可以沿著下文還稱為z軸的檢測軸線來捕獲圖像的堆棧(z-堆棧)，并且可以出于三維成像的目的(例如樣品的形貌)組合這些圖像。

發明內容

本發明基于以下目的，提出三維成像的改進選項，特別是使用低照明強度。

該目的通過下文所述的顯微成像方法來實現。在下文中發現有利的發展例。

顯微成像方法包含以下步驟：用照明輻射照明樣品并沿著檢測軸線捕獲檢測輻射，所述檢測輻射已經由照明輻射引起。在第一次時，檢測輻射被捕獲作為寬場信號，在第二次時，檢測輻射被捕獲作為復合信號，所述復合信號由共焦圖像或其信號以及寬場信號的疊加來形成。共焦圖像通過從復合圖像減去寬場圖像，并使用校正因子來獲得。在此，從復合信號中減去寬場圖像信號，并考慮校正因子。

該方法的特征在于，為每個執行的成像和/或為每個成像的樣品來確定當前校正因子。使用相應的當前校正因子來提取相應的共焦圖像。

令人意外地，發現為最初設想的應用設定一次成像系統的校正因子是完全足夠的；然而，根據本發明的方法不僅減少成像像差而且允許檢查新類別的材料。