[發明專利]一種加強型高效治療肺癌的NK免疫細胞的制備方法及應用

在審

• 申請號: 201910556693.5
• 申請日: 2019-06-25
• 公開（公告）號: CN110205293A
• 公開（公告）日: 2019-09-06
• 發明（設計）人: 江良旗
• 申請（專利權）人: 中冠賽爾生物科技（北京）有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 北京知呱呱知識產權代理有限公司 11577
• 代理人: 杜立軍;孫志一

本發明實施例公開了一種加強型高效治療肺癌的NK免疫細胞的制備方法及應用，該制備方法包括如下步驟：(a)將刺激因子包被培養瓶；(b)在人外周血液中分離單個核細胞；(c)在刺激因子包被的培養瓶中添加活化培養基，再將單個核細胞接種于刺激因子包被的培養瓶中進行培養；(d)待培養3?4天后，將單個核細胞移入空培養瓶中，再向空培養瓶中添加活化培養基繼續培養；(e)待培養7?8天后，將單個核細胞移入培養袋中，再向培養袋中添加活化培養基繼續培養，待培養14?16天后，收集單個核細胞；上述方法將單個核細胞在體外共培養2?3周，能使NK免疫細胞擴增500?1000倍以上，且NK免疫細胞含量達到90％以上，并能夠增強NK免疫細胞的活性，使其對K562瘤細胞的體外殺傷率達90％以上。

技術領域

本發明實施例涉及免疫細胞擴增技術領域，具體涉及一種加強型高效治療肺癌的NK免疫細胞的制備方法及應用。

背景技術

細胞治療是繼化療、手術、放療之后的一個新興生物醫藥領域，是治療疾病最好的方法之一。腫瘤的細胞治療是一種全身性的免疫療法，是把人體自身或異體的免疫細胞，進行體外培養、增殖，形成數量眾多，活性超強的免疫抗癌細胞，再回輸到患者體內，發揮強大的抗癌作用。與手術、放療及化療對免疫損傷不同，細胞治療能大大提高患者的抗癌免疫力，清除手術治療不能觸及的血液、淋巴或轉移到其他組織中的癌細胞、甚至是休眠的癌細胞，相比之下治療更加徹底。免疫活性細胞具有促進自身愈合和再生的能力，細胞治療有長期的效果。用細胞治療疾病，毒副作用小，安全有效。

NK免疫細胞是機體抗腫瘤、抗病毒的主要免疫活性細胞。其他幾個具有抗癌功能的細胞包括殺傷性T細胞、巨噬細胞、網狀內皮細胞(DC)；由于巨噬細胞內含有很多炎癥因子，目前還無法用于細胞治療；DC是一類免疫調節細胞，主要作用是抗原加工并呈遞給T細胞，再靠T細胞發揮抗癌作用；所以，DC一般是用于制備治療性疫苗；美國FDA已經批準了一個前列腺癌的DC治療性疫苗。T細胞的抗癌作用需要再次激發才有效，只有經DC活化后才能起作用；T細胞初次遇到抗原時并無殺傷作用，而只是形成免疫記憶；只有再次遇到抗原后，才能激發出強有力的殺傷功能。現在很多人用的CIK中主要是經細胞因子活化的T細胞。其實，未經DC抗原呈遞、單獨靠細胞因子活化的殺傷T細胞的療效是非常有限的。NK免疫細胞的全名叫自然殺傷細胞，其特點之一是初次遇到就有殺傷作用。NK免疫細胞還可與抗體聯合使用，通過抗體介導的殺傷效應(ADCC)，一方面賦予NK免疫細胞特異性，另一方面使抗體具有更強的治療效果；現在臨床上使用的大多數抗癌單抗的治療機理中，NK免疫細胞往往起著重要的作用。另外，T細胞和網狀內皮細胞必須用自身的，因為網狀內皮細胞不能呈遞抗原給異體的T細胞，而異體的殺傷性T細胞會引起移植物宿主反應；但NK免疫細胞可以用同種異體的，往往正是因為這些自身細胞的免疫功能差，才發生腫瘤等疾病。再用那些功能本來就差的細胞來治療，療效難以太好。NK免疫細胞則不同，可以用健康人的NK免疫細胞，有望產生更好的療效。

目前，大量制備活化的人NK免疫細胞的方法主要有兩種：一是采用抗體并通過紅細胞或磁性微球的分離法，直接從PBMC中分離NK免疫細胞；可以快速獲得NK免疫細胞，但由于NK免疫細胞在PBMC中的比例很少，所得NK免疫細胞的數目不多，只適用于小規模制備NK免疫細胞及分析性研究；此外，正常的NK免疫細胞一般都處于抑制狀態，直接使用時，即使有足夠量的NK免疫細胞也很有可能沒有抗癌作用。二是體外擴增法，從PBMC中擴增培養NK免疫細胞：也就是用PBMC或者已經分離的NK免疫細胞，通過一些特殊細胞因子的刺激，使NK免疫細胞在體外擴增，但是，至今大多體外擴增技術只能使NK免疫細胞擴增幾十倍，且純度低、活性差、成本高。

發明內容

為此，本發明實施例提供一種加強型高效治療肺癌的NK免疫細胞的制備方法，以解決現有技術中NK免疫細胞擴增中存在的NK免疫細胞數量少、抗癌作用差、擴增倍數少、純度低、活性差以及成本高的問題。

為了實現上述目的，本發明實施例提供如下技術方案：