[發明專利]一種制備動物成熟神經元單細胞的方法

在審

• 申請號: 201910553747.2
• 申請日: 2019-06-25
• 公開（公告）號: CN110218700A
• 公開（公告）日: 2019-09-10
• 發明（設計）人: 肖振
• 申請（專利權）人: 上海卡序生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0793
• 分類號: C12N5/0793
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發明公開了一種制備動物成熟神經元單細胞的方法，屬于成熟神經元單細胞分離技術領域。本發明首先利用D?PBS對小鼠進行灌流，將血細胞去掉，避免了血細胞對后續分離的影響；利用Hibernate?A作為消化過程中的培養基，可以不考慮預先通氧或者消化過程中通氧的問題，可有效節約至少30min時間，減少對神經元的傷害；此方法不需要特別的儀器即可進行單細胞制備；本方法可同時分離出寡突膠質細胞、星形膠質細胞、神經元，可在同一批次樣品中對不同類型的神經細胞進行測序或者功能分析，可減少實驗誤差，節約成本。

技術領域

本發明涉及一種制備動物成熟神經元單細胞的方法，屬于成熟神經元單細胞分離技術領域。

背景技術

在生物體內，每個細胞都是獨一無二的，即使是同一器官或者組織中的同種類型的細胞也都具有異質性。大腦作為生物體最重要的器官，具有其獨有的特征，如成熟神經元高度分化，不可進行細胞分裂，這可能會導致很多神經退行性疾病及精神類疾病的發生，如阿爾茲海默癥、帕金森綜合征等。

通過單細胞測序可以了解細胞之間的異質性，找到特異性參與某種疾病的特定類群神經元，同時也能對某一個腦區的神經元重新分類，原來由于技術的限制，對神經元的分類相對來講不是很完善，單細胞測序技術可以解決這一問題。由于成熟神經元具有復雜的軸突樹突系統，導致其在進行單細胞分離時會產生大量的雜質，同時，由于神經元對氧氣和營養的需求量較其他細胞高，分離過程中神經元容易死亡。目前市場上僅有一款成熟神經元的分離試劑盒，即美天旎公司生產的大小鼠成熟神經元分離試劑盒，該試劑盒十分昂貴且需要用到美天旎公司特有的儀器，該儀器造價在30-50萬/臺，同時，該試劑盒最后進行血細胞的分離，會降低神經細胞的得率，所以其使用率很低，目前很少有使用該試劑盒發表的文章。而制備成熟神經元的文章雖然有很多可以參考，但是都存在需要特殊的設備、不能將神經細胞徹底地消化分離、不能同時分離神經元和不同類型的神經細胞等問題。因此，提供一種操作簡便、成本低、省時、無需借助特定的儀器、適合工業化生產的成熟神經元分離的方法，對于神經單細胞測序或者進行其他分析有重要的應用價值。

發明內容

本發明的目的是提供一種制備成熟神經元單細胞的方法，所述方法具體包括以下步驟：

(1)獲取目的動物組織，所述目的動物組織中含目的動物神經細胞；

(2)將切碎后的目的動物組織與HABG消化緩沖液混合，每3-8mg組織添加1mLHABG，進行組織消化，消化條件為33-37℃恒溫，100-200rpm消化20-50min；

(3)將消化后的組織進行離心，留沉淀，加入HABG消化緩沖液吹打沉淀；

(4)將(3)中獲得的溶液中的未被消化的組織及大的碎片過濾掉；

(5)將(4)中獲得的含有細胞的HABG溶液加入到細胞梯度分離液中，含有目的動物神經細胞的HABG溶液和梯度分離液的體積比為3:2-2:1，混勻后離心。

在本發明的一種實施方式中，步驟(3)中將消化好的組織于180-200g，3-5℃離心5-8min，棄上清，沉淀中加入無菌HABG，槍頭先酒精燈上拋光，防止傷害細胞，用槍頭輕輕吹打，3-6s吹打一個來回，共吹打3-5次，吹打過程中不要產生氣泡，切記一定要輕輕吹打，防止傷害細胞；如果死亡率超過預想值或者最后的細胞碎片依然較多，降低減少吹打次數，但是細胞得率會降低，需求的組織量就要相應增加。

在本發明的一種實施方式中，步驟(4)中將預先用D-PBS浸潤過的10-100μm的篩網套至干凈的離心管中，將上述含有目的動物神經細胞的HABG溶液加入篩網中過濾未被消化的組織及大的碎片。

在本發明的一種實施方式中，于無菌環境中配置如下細胞梯度分離液并按表1從上到下小心依次加入到15mL離心管中待用，為減少各層之間的混合，預先將離心管內壁濕潤，以便液體均勻緩慢留下。

表1梯度分離液