[發明專利]一種EB66細胞株懸浮生長無血清化學成分界定培養基及其制備方法

在審

• 申請號: 201910551879.1
• 申請日: 2019-06-25
• 公開（公告）號: CN110317778A
• 公開（公告）日: 2019-10-11
• 發明（設計）人: 蔡仕君;陳瑞愛;羅順;李延鵬;沈永義;黃梅;葉俊賢;王嘉琪;溫良海;羅瓊
• 申請（專利權）人: 華農（肇慶）生物產業技術研究院有限公司
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735;C12N5/02
• 代理公司: 廣州市科豐知識產權代理事務所(普通合伙) 44467
• 代理人: 龔元元

本發明屬于培養基領域，具體為一種EB66細胞株懸浮生長無血清化學成分界定培養基，添加劑A中各物質在所述培養基中濃度為：胰島素1?10mg/L；IGF?1 5?10μg/L；腐胺0.5?2mg；谷胱甘肽0.5?5mg/L；乙醇胺1?5mg/L；β?巰基乙醇10?50μM；卵磷脂1?5mg/L；維生素C 10?50mg/L；牛磺酸50?100mg/L；膽固醇2?5mg/L；谷氨酰胺3?6mM；每1L培養基中所述氨基酸混合組分添加量為1000mg?3000mg。該培養基支持EB66細胞在無血清、全懸浮的條件下快速增殖，倍增時間短。細胞呈現較高密度，同時，本發明還提供該培養基的制備方法。

技術領域

本發明涉及培養基領域，具體為一種EB66細胞株懸浮生長無血清化學成分界定培養基。

背景技術

EB66細胞株是由法國生物科技名企Valneva從鴨胚胎干細胞中提取并馴化的可傳代細胞。Valneva總部坐落于法國里昂，致力于疫苗技術研發、生產和商業化創新，在疫苗領域擁有很高的國際影響。Valneva選擇未檢出內源性逆轉錄酶病毒表達的鴨子，收集鴨胚胎，提取鴨胚胎干細胞，經過馴化傳代得到的基因穩定的EB66細胞株，具有胚胎干細胞源性，無致瘤性，不經過任何基因改造，病毒和化學修飾。

EB66細胞株是鴨胚胎干細胞衍生細胞株，具有干細胞的源性，無致瘤性，已在美國FDA備案，BMF中包括細胞株全部的歷史，在多個國家擁有多項專利，在中國申請了五項專利保護。具有全懸浮無血清培養，倍增時間短，可高密度生長，病毒敏感性廣等特性。EB66細胞株病毒易感性。

目前，大多數禽類疫苗如AIV、NDV、IBV、EDS等基本依靠雞胚或鴨胚生產，雞胚作為病毒培養的基質，需要經過嚴格工序來保證其品質。首先，合格的雞胚除了能正常生產禽流感病毒外，還應該是健康雞群產下的受精卵，例如SPF海蘭白雞；其次，生產中一般要求產蛋雞的年齡不超過1周年；再者，為確保雞群在生長過程中沒有感染任何禽流感等相關疾病，必須經過定期檢測，同時要嚴格確保受精卵內不能帶有任何病毒。受到這些因素的限制，導致無特定病原體(Spedfic Pathogen Free,SPF)的雞胚產量小、成本高，往往不能滿足大批量生產禽流感疫苗的需求。除此之外，雞胚培養還存在諸多問題，不同批次的雞胚質量往往存在差異，難以控制品質，而不同質量的雞胚會對病毒培養產生不同副作用，且雞胚的來源容易受到禽流感疫情的影響；此外，雞胚是許多細菌的天然宿主，容易受到環境中細菌的感染，己有研究者指出由母體遺傳給雞胚所帶來的潛在污染比GMP車間無菌環境中人為操作所帶來的污染化率大很多，而這也正是雞胚培養過程中難以控制的地方。另外，在雞胚的尿囊液中含有大量動物源蛋白，在提取病毒時易被帶入病毒液中，導致成品疫苗中有大量動物源蛋白，從而引起過敏反應等副作用。

血清能為細胞提供生長增殖所需的激素、生長因子、轉移蛋白和其它營養物質，但其存在諸多缺點：批間差異較大，來源不穩定，需要大量驗證工作，價格昂貴，成分不明確，不利于疫苗和單克隆抗體等目的產品的分離純化，容易被病毒和支原體感染等。無血清培養基是在基礎培養基的基礎上，加入血清替代成分，制備得到的培養基既能滿足細胞的培養要求，又能有效避免因使用血清帶來的諸多不利因素。研發一種培養EB66細胞用的無血清培養基，可有效降低后續病毒純化的分離難度，同時也可有效提高疫苗的安全性。

本公司在多年前就開始了無血清培養基的研究，在專利ZL201510965947.0中，公開了一種用于培養病毒的無血清培養基，該培養基由以下重量百分數計的組分制備而成：80-90％培養液、4-10％氨基酸、3-10％血清替代因子和0.05-0.5％抗氧化劑。同時還提供該培養基的制備方法：分別取配方量的培養液、氨基酸、血清替代因子和抗氧化劑，混合，即得。其用于培養病毒的無血清培養基，便于病毒繁殖結束后的病毒液的純化，降低了疫苗生產成本；此外制備方法簡單、易操作。但是上述的培養基經過試驗并不能使EB66細胞株達到18*10⁶cells/ml的濃度，即使如該案所述，其氨基酸濃度達到了4-10的狀態，其用于培養EB66細胞株，其細胞株峰值濃度低于10*10⁶cells/ml。