[發(fā)明專利]檢測(cè)中蜂蜂蜜與意蜂蜂蜜的ELISA檢測(cè)試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910550683.0
• 申請(qǐng)日: 2019-06-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110376384B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-06-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡福良;張言政;鄭火青;張翠平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/68
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/68;G01N33/58;G01N33/543;G01N33/535;C12N15/12;C12N15/70;C07K14/435
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 趙杭麗

1.一種檢測(cè)中蜂蜂蜜與意蜂蜂蜜的ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于，試劑盒包含以下成分：包被中蜂MRJP2和意蜂MRJP2同一性抗體的酶標(biāo)板、HRP標(biāo)記的特異性中蜂MRJP2抗體、HRP標(biāo)記的特異性意蜂MRJP2抗體、樣品稀釋液、清洗液、TMB顯色劑A、TMB顯色劑B、陽(yáng)性對(duì)照。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)中蜂蜂蜜與意蜂蜂蜜的ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于，以制備得到的中蜂MRJP2和意蜂MRJP2同一性和特異性抗體為基礎(chǔ)，以雙抗體夾心法建立中蜂蜂蜜與意蜂蜂蜜檢測(cè)的ELISA方法。

3.權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)中蜂蜂蜜與意蜂蜂蜜的ELISA檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于，通過(guò)以下步驟獲得：

（1）目標(biāo)抗原的選擇：選擇MRJP2作為中蜂蜂蜜與意蜂蜂蜜抗體制備的目標(biāo)蛋白；

（2）MRJP2的制備：確定原核表達(dá)純化方案，優(yōu)化MRJP2蛋白原核表達(dá)條件，得到中蜂MRJP2和意蜂的MRJP2；

（3）MRJP2多克隆抗體的制備純化：制備中蜂MRJP2和意蜂MRJP2兔多克隆抗體，親和純化得到中蜂MRJP2和意蜂MRJP2的特異性和同一性抗體；

（4）試劑盒的制備：采用雙抗夾心法，以中蜂MRJP2和意蜂MRJP2同一性抗體包被酶標(biāo)板，以HRP標(biāo)記抗中蜂MRJP2抗體和抗意蜂MRJP2抗體，用TMB底物系統(tǒng)顯色。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟（2）中，中蜂MRJP2和意蜂MRJP2原核表達(dá)純化方案為去除信號(hào)肽后進(jìn)行序列優(yōu)化，中蜂MRJP2 Ｎ端的1-25個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，其序列如SEQ.No.1所示:MTKWLFMVACLGIACQGAIIRQNS，意蜂MRJP2 Ｎ端的1-17個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，其序列如SEQ.No.2所示:MTRWLFMVACLGIACQ，中蜂MRJP2去除1-25氨基酸，進(jìn)行氨基酸序列優(yōu)化，優(yōu)化后的中蜂MRJP2序列如SEQ.No.3所示，然后進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的中蜂MRJP2的DNA序列如SEQ.No.4所示，意蜂MRJP2去除1-17氨基酸，進(jìn)行氨基酸序列優(yōu)化，優(yōu)化后的意蜂MRJP2序列如SEQ.No.5所示，然后進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的意蜂MRJP2的DNA序列如SEQ.No.6所示，利用C端HIS標(biāo)簽純化蛋白，酶切位點(diǎn)選擇Nde I和Xho I，表達(dá)載體選擇pET-22b(+)，感受態(tài)細(xì)胞為大腸桿菌BL21；MRJP2蛋白原核表達(dá)條件范圍為：溫度15℃-37℃，時(shí)間4 h-16 h，IPTG終濃度為0.2 mM-1.0 mM；中蜂MRJP2原核表達(dá)最適誘導(dǎo)條件為15℃誘導(dǎo)16 h，IPTG終濃度為0.2 mM；意蜂MRJP2原核表達(dá)最適誘導(dǎo)條件為37℃誘導(dǎo)4 h，IPTG終濃度為0.2 mM。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟（4）所述HRP標(biāo)記的抗中蜂MRJP2抗體稀釋倍數(shù)為1000-2000倍，HRP標(biāo)記的抗意蜂MRJP2抗體稀釋倍數(shù)為4000-8000倍。

6.權(quán)利要求1所述試劑盒在中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的檢測(cè)中的應(yīng)用。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括中蜂蜂蜜與意蜂蜂蜜蜂種來(lái)源真實(shí)性的檢測(cè)、意蜂蜂蜜摻假中蜂蜂蜜的檢測(cè)，以及中、意蜂蜂蜜相關(guān)產(chǎn)品的檢測(cè)。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)：加樣、洗板、加入HRP標(biāo)記的中蜂MRJP2抗體和HRP標(biāo)記的意蜂MRJP2抗體、洗板、顯色。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，對(duì)蜂蜜樣品進(jìn)行直接檢測(cè)，或?qū)Ψ涿鄣鞍滋崛∥镞M(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)，蜂蜜樣品稀釋倍數(shù)為5-200倍，對(duì)蜂蜜蛋白提取物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，蜂蜜水溶性蛋白濃度檢測(cè)范圍為0.01 μg/mL-10 mg/mL，室溫或37℃，蜂蜜樣品反應(yīng)時(shí)間和HRP標(biāo)記抗體反應(yīng)時(shí)間在15-30 min。

10.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)8所述的應(yīng)用，其特征在于，通過(guò)肉眼觀察待測(cè)樣品顯色情況，根據(jù)顯色為藍(lán)色的微孔所加的酶標(biāo)抗體對(duì)應(yīng)的蜂種信息，判斷此蜂蜜樣品是中蜂蜂蜜還是意蜂蜂蜜，如果兩孔都為藍(lán)色，則該蜂蜜樣品為摻有意蜂蜂蜜的中蜂蜂蜜。