[發明專利]植物作為宿主表達人源端粒酶的應用

在審

• 申請號: 201910549715.5
• 申請日: 2019-06-24
• 公開（公告）號: CN110205337A
• 公開（公告）日: 2019-09-06
• 發明（設計）人: 王躍駒;陳書元;唐輝
• 申請（專利權）人: 王躍駒
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/54;C12N9/12
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 劉穎

本發明涉及生物技術領域，特別涉及植物作為宿主表達人源端粒酶顯著延長生物壽命。本發明利用植物例如生菜作為重組蛋白質生產的有效表達平臺，利用簡單以及有效的農桿菌介導真空滲透方法來表達人源端粒酶。該表達體系確定植物外源蛋白在農桿菌侵染4天后就可以收集。利用Western Blot蛋白雜交法確定端粒酶成功表達，用AKTA蛋白純化系統成功純化出端粒酶。秀麗隱桿線蟲的壽命測試結果表明利用該平臺技術生產的端粒酶顯著延長壽命。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及植物作為宿主表達人源端粒酶顯著延長生物壽命。

背景技術

2009年10月5日瑞典皇家科學院諾貝爾獎委員會宣布將2009年度諾貝爾生理學或醫學獎授予3位美國科學家伊利莎芭.布萊克本(Elizabeth H.Blackburn),卡蘿爾.格雷德(CarolW.Greider)和杰克.紹斯塔克(Jack W.Szostak)，以表彰他們“發現端粒和端粒酶是如何保護染色體的”。他們的發現闡明了端粒酶的作用--使端粒的長度和結構得以穩定，從而保護染色體、細胞隨著端粒的變短而衰老，而當端粒酶的活性足以維護端粒的長度時，細胞將會延遲衰老，在癌細胞得到永久性這一過程中，端粒酶的激活起了非常重要的作用。相反，一些遺傳病正是由于端粒酶的活性缺陷最終導致細胞的損傷，正是由于三位科學家的開創性工作讓人們指導端粒和端粒酶不僅與染色體的特質和穩定性密切相關，而且還設計細胞的衰老與損傷、癌癥的發生等方面。

端粒酶(Telomerase)是使端粒延伸的反轉錄DNA合成酶。是個由RNA和蛋白質組成的核糖核酸-蛋白復合物。其RNA組分為模板，蛋白組分具有催化活性，以端粒5'末端為引物，合成端粒重復序列。端粒酶的活性在真核細胞中可檢測到，其功能是合成染色體末端的端粒，使因每次細胞分裂而逐漸縮短的端粒長度得以補償，進而穩定端粒長度。主要特征是用它自身攜帶的RNA作模板，以dNTP為原料，通過逆轉錄催化合成后延長鏈5‘端DNA片段或外加重復單位。端粒酶在細胞中的主要生物學功能，是通過其逆轉錄酶活性復制和延長端粒DNA來穩定染色體端粒DNA的長度。

近年有關端粒酶與腫瘤關系的研究進展表明，在腫瘤細胞中端粒酶還參與了對腫瘤細胞的凋亡和基因組穩定的調控過程。與端粒酶的多重生物學活性相對應，腫瘤細胞中也存在復雜的端粒酶調控網絡。通過蛋白質-蛋白質相互作用在翻譯后水平對端粒酶活性及功能進行調控，則是目前研究端粒酶調控機制的熱點之一。但目前的表達系統耗時長，純化工藝復雜，存在基因污染，感染人體的潛在病蟲害等問題，且生產成本較高，存在產品安全性的隱患。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了植物作為宿主在表達端粒酶中的應用。本發明利用植物尤其是生菜作為重組蛋白生產的高效平臺技術，表達了端粒酶。并且在溫和的條件下成功分離出有活性的外源蛋白，證明植物尤其是生菜表達平臺可以成功用來生產端粒酶蛋白。時間短(4d)，純化簡單，生產便捷。消除基因污染，消除感染人體的潛在病蟲害等。大大降低生產成本，提高產品安全性。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了植物作為宿主在表達端粒酶中的應用；所述植物選自生菜、菠菜、番茄、蘿卜、白菜、玉米、大豆、小麥或煙草；所述植物的器官選自種子、葉、根莖或整株植物。

植物瞬時表達技術是在植物生長到一定階段，利用多種不同的技術方式將含有目標蛋白的質粒轉移到植物細胞中，在植物細胞中建立高效、可控的表達系統，獲得該基因短暫的可控表達的技術。與穩定表達相比，瞬時表達所需時間短，不需要將外源基因整合到宿主植物染色體中，僅需幾天的時間就可拿到實驗結果。與細菌表達系統相比，植物表達系統可以對所表達的蛋白進行正確的折疊、加工、修飾，所生產的蛋白活性高于細菌表達系統；與動物細胞表達系統相比，植物表達系統的前期投入成本非常低，僅為其百分之一到百分之五。本研究還發現，重組人源端粒酶顯著延長秀麗隱桿線蟲的壽命。

在上述研究的基礎上，本發明還提供了一種表達載體，包括端粒酶的序列以及雙元植物載體。