[發明專利]一種重組畢赤酵母工程菌及其在合成左旋多巴中的應用

有效

• 申請號: 201910549697.0
• 申請日: 2019-06-24
• 公開（公告）號: CN110305805B
• 公開（公告）日: 2021-07-13
• 發明（設計）人: 袁圍;鐘爽;肖延銘;華超;汪釗;祁瑛;梁阿朋
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學;長興制藥股份有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N15/60;C12N15/31;C12P13/22;C12R1/84
• 代理公司: 浙江千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 黎雙華;李欣瑋

本發明公開了一種重組畢赤酵母工程菌及其在合成左旋多巴中的應用。本發明的重組畢赤酵母工程菌通過如下方法獲得：將SEQ ID NO.1所示的酪氨酸酚裂解酶(TPL)的DNA序列進行密碼子優化后，轉入到畢赤酵母GS115，構建重組畢赤酵母YZ001，隨后將SEQ ID NO.4所示的HAC1在畢赤酵母YZ001中過量表達，構建獲得重組畢赤酵母工程菌YZ002。本發明重組畢赤酵母工程菌發酵離心后的上清液可有效用于合成左旋多巴，離心后的菌體可以用于下一批次的發酵，這不僅提高了左旋多巴的合成效率和使用率、節約生產成本，并為左旋多巴的生產加工開辟新的工業化途徑。

技術領域

本發明涉及一種重組畢赤酵母工程菌及其在合成左旋多巴中的應用，屬于生物工程領域。

背景技術

左旋多巴是一種應用于治療帕金森病，肝性腦病，神經痛，高泌乳素血癥等疾病的常見藥物，在醫藥市場具有巨大的應用價值。目前制備左旋多巴的方法主要有植物提取法，化學合成法和生物酶轉化法。但是植物提取法和化學合成法均存在工藝繁瑣，成本高，污染環境等缺點。而生物酶催化方法合成左旋多巴綠色環保，集約高效，目前已成為左旋多巴工業化的主要方法。

生物酶轉化法主要是以酪氨酸酚裂解酶(TPL)為催化劑，以鄰苯二酚、丙酮酸和醋酸氨為底物，催化合成左旋多巴。目前報道的來源于具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum)、氟式檸檬酸桿菌(Citrobacter frenudii)、草生歐文氏菌(Erwiniaherbicola)、嗜熱菌(Symbiobacterium SP.)，克呂沃爾氏菌(Kluyvera intermedia)等的TPL，已經成功在細菌中表達，并應用于生產。

雖然利用細菌表達TPL在工業上已經開始得到了應用，但是仍然受到多方面限制。首先，細菌如大腸桿菌表達TPL之后需要經破壁處理釋放胞內的TPL，增加了工藝步驟和能耗，且破壁過程中易造成酶活的降低。其次，細菌容易受到噬菌體感染，容易使得發酵失敗。

畢赤酵母作為一類能夠利用甲醇為唯一碳源和能源的酵母菌，具有如下優點：1.具有目前最強的啟動子，醇氧化酶基因啟動子(P_AOX1)；2.表達效率高，其外源蛋白的表達量可占總表達蛋白的90％以上；3.可實現外源蛋白的分泌表達，減少細胞破壁的后處理工序；4.在簡單合成培養基中即可實現高密度發酵；5.表達的質粒能整合在基因組中特定位點，遺傳特性穩定。6.畢赤酵母表達酪氨酸酚裂解酶不會受到噬菌體感染，避免了倒罐帶來的損失。7.以甲醇作為唯一碳源和能源，價格低廉，有利于工業化生產。此外，轉錄因子Hac1作為內質網響應蛋白，在畢赤酵母中參與轉錄調控，有研究表明，過量表達Hac1能顯著提高外源蛋白在畢赤酵母中的表達量。

基于畢赤酵母的以上優勢，開發用畢赤酵母分泌表達TPL來實現工業化生產左旋多巴就顯得十分必要。

發明內容

本發明的目的是提供一種重組畢赤酵母工程菌及其在合成左旋多巴中的應用。

為了達到上述的目的，本發明采取以下技術方案：

一種重組畢赤酵母工程菌，所述重組畢赤酵母工程菌通過如下方法獲得：將SEQID NO.1所示的酪氨酸酚裂解酶(TPL)的DNA序列進行密碼子優化后，轉入到畢赤酵母GS115，構建重組畢赤酵母YZ001，隨后將SEQ ID NO.4所示的HAC1在畢赤酵母YZ001中過量表達，構建獲得重組畢赤酵母工程菌YZ002。

進一步地，所述重組畢赤酵母工程菌的制備方法具體為：

(1)將SEQ ID NO.1所示的酪氨酸酚裂解酶(TPL)的DNA序列進行密碼子優化后克隆至畢赤酵母表達載體pPIC9K而獲得的表達載體pPIC9K-TPL，將pPIC9K-TPL線性化后，轉入畢赤酵母GS115獲得重組畢赤酵母YZ001；