[發(fā)明專利]一種用于產(chǎn)氣腸桿菌檢測(cè)的試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910549661.2
• 申請(qǐng)日: 2019-06-24
• 公開（公告）號(hào): CN110241237B
• 公開（公告）日: 2020-04-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫澤瑋;陳文靜;鄭良榮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/689
• 分類號(hào): C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/10
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 趙杭麗

本發(fā)明提供一種用于產(chǎn)氣腸桿菌檢測(cè)的試劑盒，包含一種特異性靶向產(chǎn)氣腸桿菌rpoB基因的向?qū)NA、擴(kuò)增引物對(duì)、水化TwistAmp basic kit反應(yīng)干燥球、LbCas12a蛋白、單鏈DNA探針(ssDNA)、Ribonuclease Inhibitor和緩沖液。使用該試劑盒進(jìn)行產(chǎn)氣腸桿菌檢測(cè)，檢測(cè)的特異性高，可以將產(chǎn)氣腸桿菌與其他腸桿菌屬細(xì)菌，包括陰溝腸桿菌、杰高維腸桿菌、阪崎腸桿菌區(qū)分開來。同時(shí)，使用本發(fā)明所述RNA序列進(jìn)行檢測(cè)，耗時(shí)在1小時(shí)左右，不需要PCR儀，對(duì)設(shè)備要求低，顯著低于傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)法或PCR測(cè)序法，臨床實(shí)用價(jià)值大。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于致病菌檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種用于產(chǎn)氣腸桿菌檢測(cè)的試劑盒。利用此試劑盒可以進(jìn)行產(chǎn)氣腸桿菌快速檢測(cè)。

背景技術(shù)

產(chǎn)氣腸桿菌是人體感染的革蘭陰性菌中常見菌群，給患者及社會(huì)帶來巨大負(fù)擔(dān)。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法是進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)或PCR聯(lián)合測(cè)序，但細(xì)菌培養(yǎng)需要5-7天的時(shí)間，而PCR常由于缺乏特異性引物，無法將產(chǎn)氣腸桿菌與其他腸桿菌屬細(xì)菌區(qū)分，故而需要聯(lián)合一代測(cè)序才能鑒定，成本高，需要數(shù)天時(shí)間才能出結(jié)果。在這期間臨床醫(yī)師由于沒有獲得檢測(cè)結(jié)果，只能憑經(jīng)驗(yàn)用藥，常常導(dǎo)致疾病治療的延誤。因而，如何快速檢測(cè)產(chǎn)氣腸桿菌顯得尤為重要。近期，張峰等人發(fā)現(xiàn)，LbCas12a蛋白可用于致病菌的檢測(cè)，只需要1小時(shí)左右即可完成檢測(cè)，省時(shí)省力，靈敏度高。具體的原理為，該系統(tǒng)包含LbCas12a蛋白、致病菌DNA、向?qū)NA、兩端分別帶熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的單鏈DNA(ssDNA)。其中，致病菌DNA序列需要包含TTTN的PAM結(jié)構(gòu)，同時(shí)該序列需要具備特異性，即區(qū)別于別的致病菌。而向?qū)NA序列為致病菌特異性靶向序列中TTTN后的一段序列，長(zhǎng)度為20-24個(gè)堿基。在向?qū)NA引導(dǎo)下，LbCas12a蛋白可結(jié)合到致病菌特異性DNA序列上，隨后，LbCas12a蛋白可表現(xiàn)出Dnase活性，從而切割兩端分別帶熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的單鏈DNA，使得熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，出現(xiàn)熒光，從而指示致病菌的存在。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種用于產(chǎn)氣腸桿菌檢測(cè)的試劑盒，包含一種特異性靶向產(chǎn)氣腸桿菌rpoB基因的向?qū)NA、RPA擴(kuò)增引物對(duì)、水化TwistAmp基礎(chǔ)試劑盒(TwistAmpbasic kit)反應(yīng)干燥球、LbCas12a蛋白、單鏈DNA探針(ssDNA)、RNA酶抑制劑(RibonucleaseInhibitor)和緩沖液。其中特異性靶向產(chǎn)氣腸桿菌rpoB基因的向?qū)NA，其核苷酸序列如SEQ No.1所示，能特異性靶向產(chǎn)氣腸桿菌，而不能靶向陰溝腸桿菌、杰高維腸桿菌、阪崎腸桿菌，可用于產(chǎn)氣腸桿菌的檢測(cè)。RPA擴(kuò)增引物對(duì)RPA-F和RPA-R，序列如SEQ No.2和SEQNo.3所示。單鏈DNA探針的序列如SEQ No.6所示。

本發(fā)明提供所述試劑盒進(jìn)行產(chǎn)氣腸桿菌快速檢測(cè)的方法，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)：

具體步驟為：取1ml樣品，95-98攝氏度加熱5min，取1μl作為檢測(cè)樣品，加入14.75μl水化TwistAmp basic kit反應(yīng)干燥球(TwistDx公司)，0.9μl 10mM RPA-F(序列為SEQNo.2)和RPA-R(序列為SEQ No.3)，0.375μl Ribonuclease Inhibitor(Takara公司)，3.5μlbuffer2.1(NEB公司)，1000nM向?qū)NA(序列為SEQ No.1)，250nM Cas12a(NEB公司)，200nM單鏈DNA探針(上海生工，序列為SEQ No.6)，加水補(bǔ)至25μl。37攝氏度反應(yīng)25-45min，通過熒光顯微鏡下直接觀察檢測(cè)體系熒光變化，進(jìn)行產(chǎn)氣腸桿菌檢測(cè)；發(fā)黃綠色熒光說明有產(chǎn)氣腸桿菌污染，不發(fā)光說明沒有產(chǎn)氣腸桿菌污染。本方法可以將產(chǎn)氣腸桿菌與其他腸桿菌屬細(xì)菌，包括陰溝腸桿菌、杰高維腸桿菌、阪崎腸桿菌區(qū)分開來。

其中：

所述單鏈DNA探針ssDNA序列(SEQ No.6)為：5’6-FAM-TTATT-3’BHQ1，由上海生工合成。