[發明專利]一種檢測隱色素基因CRY1啟動子甲基化的引物及方法

在審

• 申請號: 201910547280.0
• 申請日: 2019-06-24
• 公開（公告）號: CN110195108A
• 公開（公告）日: 2019-09-03
• 發明（設計）人: 吳明彩;蔣明;章堯;呂俊;徐蕾;薛夢雅;程彬;李青
• 申請（專利權）人: 皖南醫學院
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京元本知識產權代理事務所 11308
• 代理人: 范奇

1.一種檢測隱色素基因CRY1啟動子甲基化的引物，其特征在于，該引物包括與發生甲基化的模板匹配的甲基化上游引物MF和甲基化下游引物MR，與未發生甲基化的模板匹配的非甲基化上游引物UF和非甲基化下游引物UR，所述甲基化上游引物MF：

5′-TATTATTGGTTTTTGAAGGAAATCG-3′，甲基化下游引物

MR:5′-CTACGTTCCAAAAAATAAAAAAACG-3′；其中，下劃線標注的是和發生了甲基化的DNA相匹配的位點。

2.根據權利要求1所述的一種檢測隱色素基因CRY1啟動子甲基化的引物，其特征在于，所述非甲基化上游引物UF：

5′-TTATTATTGGTTTTTGAAGGAAATTG-3′，非甲基化下游引物UR：

5′-TACATTCCAAAAAATAAAAAAACAAA-3′；其中，下劃線標注的是和未發生甲基化DNA相匹配的位點。

3.根據權利要求1所述的一種檢測隱色素基因CRY1啟動子甲基化的引物，其特征在于，所述引物中甲基化上游引物和下游引物的濃度比為1：1。

4.根據權利要求1所述的一種檢測隱色素基因CRY1啟動子甲基化的引物，其特征在于，所述引物中非甲基化上游引物和下游引物的濃度比為1：1。

5.根據權利要求1所述的一種檢測隱色素基因CRY1啟動子甲基化的引物，其特征在于，所述引物中甲基化引物的PCR擴增產物長度為117bp。

6.根據權利要求1所述的一種檢測隱色素基因CRY1啟動子甲基化的引物，其特征在于，所述引物中非甲基化引物的PCR擴增產物長度為116bp。

7.一種檢測隱色素基因CRY1啟動子甲基化的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)提取基因組DNA樣品；

2)基因組DNA的亞硫酸氫鹽修飾：采用EZ DNA Methylation-Gold Kit對DNA進行亞硫酸氫鹽修飾和純化；

3)修飾后的基因組DNA甲基化特異性PCR：MSP反應體系25-50μL，含 HotStart Green Master Mix 12.5-25μL，EZ DNA Methylation-Gold Kit修飾后的基因組DNA模板1-2.5μL，5μmol/L上、下游引物各1-2.5μL，滅菌雙蒸水補足體積至25-50μL；

4)凝膠分析：取5μL MSP反應產物，采用2.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果進行分析。

8.根據權利要求7所述的一種檢測隱色素基因CRY1啟動子甲基化的方法，其特征在于，所述修飾后的基因組DNA甲基化特異性PCR的PCR反應條件：94℃預變性3min；94℃變性45s，60℃退火35s，-0.5℃/循環，72℃延伸50s，10個循環；95℃變性40s，55℃退火40s，72℃延伸50s，35個循環；最后72℃延伸10min。

9.權利要求1-6任意一項所述的檢測隱色素基因CRY1啟動子甲基化的引物在急性髓系白血病預后評估的應用。